简并引物设计的方法（含详细步骤）

　　简并引物设计 的方法(包括实际操作步骤)简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。主要用来同源克隆 未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方法。

　　简并引物设计的常见程序如下：

　　1. 利用NCBI 搜索不同物种 中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。

　　因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。

　　2. 对所找到的序列进行多序列比对。

　　将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对程序如BLOCK，也可选工具Clustal W，也可在线分析www.ebi.ac.uk/clustalw. 其结果如下图所示，所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。

　　3. 确定合适的保守区域。

　　设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸，因为每条引物至少18bp左右。

　　若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是至少有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。

　　4. 利用软件 设计引物。

　　当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用pp5进行简并引物的设计。将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸 序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差一个核苷酸 的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示(其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G， D=A/G /T，N=A/C/G/T)，该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在pp5中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。

　　最好使用专门的简并引物设计方法如：CODEHOP bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html

　　GeneFisher2 bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/

　　在这里我们特别值得说明的是CODEHOP方法，该方法要求的保守区较短，而且能有效的降低引物的兼并度，是一种非常有效的方法。该方法主要是通过将简并区放在3′末端，并在5′端设计一个一致性的区域来降低兼并度。

　　5. 对引物的修饰

　　若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，则其简并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度太高不利于pcr。我们可以通过用次黄嘌呤代替N(因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对)和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。

　　注意：该方法设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。

　　引物中符号说明：

　　A代表A

　　C 代表C

　　G代表 G

　　T 代表T

　　M 代表A or C

　　R 代表A or G

　　W代表 A or T

　　S代表 C or G

　　Y代表 C or T

　　K代表 G or T

　　V 代表A or C or G

　　H 代表A or C or T

　　D代表 A or G or T

　　B 代表C or G or T

　　N代表 G or A or T or C

　　由于引物的简并性的问题，所设计的引物通常简并性过高，导致有效引物利用率降低，PCR 产物非特异性增高。

　　虽然减少简并引物长度可以相对减少简并性，但随之而来的问题是引物的Tm值过低，有时不得不设计第二对引物对PCR产物进行二次扩增，即巢式PCR，或者需要与Touchdown PCR相结合使用。

　　与通常设计的简并引物不同，利用CodeHop方法设计简并引物。引物由两部分组成：引物3’端为根据4-5个保守氨基酸设计的核心简并区(3’core region)，长度只有11-15个碱基;引物5’端为非简并性夹板结构(5’consensus clamp region)。5’端夹板结构是根据密码子偏向性设计的一致性序列，它最大程度的预测了保守性氨基酸的编码序列，其长度取决于所需的退火温度 。这样设计的优点在于既减少了引物的简并度，又提高了引物的退火温度 ，保障了PCR产物的特异性。标准简并PCR在聚合反应的晚期，随着产物的增多，引物的非特异性结合的现象增多;而CodeHop PCR的晚期，这种现象大为减少。实验结果表明，按这种方法设计的简并引物非特异性扩增减少，是一种快捷方便的简并引物设计方案。