总结：PD-L1免疫组化检测难点与要点
PD-L1(programmed death ligand 1)全称程序性死亡受体配体1，是PD-1（programmed cell death 1,程序性死亡受体1）的配体。PD-L1属于细胞膜上的一个跨膜蛋白，表达在T细胞、B细胞等免疫细胞以及肿瘤细胞上，研究表明当肿瘤细胞膜上的PD-L1与T细胞等免疫细胞上的PD-1结合后，肿瘤细胞发出抑制性信号，进而T细胞不能识别肿瘤细胞和对肿瘤细胞产生杀伤作用，机体的免疫功能受到抑制。
如何筛选可能获益于PD-1/PD-L1抑制剂疗法的患者是临床最关注的问题。PD-L1免疫组化检测是预测PD-1/PD-L1抑制剂疗效的一种简单有效的方法。目前，已被FDA/NMPA批准的PD-1/PD-L1抑制剂的适应症、PD-L1检测平台和判读方法见下表。作为PD-1/PD-L1 免疫检查点抑制剂药物的疗效预测标志，PD-L1 检测已经获FDA批准作为免疫治疗的伴随诊断或补充诊断。
目前，PD-L1免疫组化检测试剂盒/抗体主要有五种：22C3、28-8、SP263、SP142和73-10，分别在两个免疫组化平台Dako和Ventana进行检测。
FDA只批准了Dako 22C3 pharmDx的PD-L1检测作为K药的伴随诊断，Dako 28-8和 Ventana SP142则分别为O药和T药（Atezolizumab）的补充诊断。Ventana SP263 被欧盟认证作为三种免疫抑制剂的补充诊断。
当前面临的检测难题：
1 不同抗体要求使用不同的检测平台
主流检测平台为两家公司的4种抗体检测平台，分别为DAKO 22C3和28-8检测的AutoStainer Link 48平台和Ventana SP142和SP263检测的Ventana Benchmark Ultra平台。
2 不同的抗体检测结果判读标准不同
目前主要PD-L1检测抗体使用的判读方法有TPS、CPS以及分别计算TC和IC判读方法，不同判读方法的主要差异在与是否计算肿瘤区域阳性表达的免疫细胞数量。
3 同一抗体在不同的肿瘤中判读方法不同
FDA批准22C3抗体的说明书中指出针对非小细胞肺癌使用TPS的判读方法，但针对胃腺癌和胃食管结合部腺癌，则建议使用CPS的判读方法。同样在宫颈癌和尿路上皮癌中亦推荐使用CPS判读方法。因此PD-L1的判读需要专业的病理医生经过大量的训练才能保证判读的准确性。
虽然已有研究证明28-8、22C3和SP263的检测结果一致性较高，但也仅是特定肿瘤类型的比较，至本在28-8和22C3的大量检测数据显示，在个别瘤种间，不同抗体型号的检测结果仍有不小的差异。此外，不同的样本类型（新鲜标本还是蜡块切片）、不同的样本来源（原发部位还是转移部位）、肿瘤样本的不同取样位置等都会导致检测结果也会存在一定的差异。因此使用不同免疫治疗药物需要使用不同的抗体进行检测，同时对PD-L1的检测平台、质控体系和人员的判读经验要求较高。
五大PD-L1检测试剂盒/抗体所针对的免疫抑制剂
1 不同检测试剂盒/抗体检测的一致性研究
近几年，国际上对于不同抗体检测的一致性研究已有不少报道。
美国学者对90例NSCLC手术切除标本分别用22C3、28-8、SP142和E1L3N检测肿瘤细胞和免疫细胞的PD-L1表达情况，由13位病理学家评估染色百分比。结果显示，采用SP142抗体在肿瘤细胞和免疫细胞中检测到的PD-L1明显减少，不同抗体检测到的肿瘤细胞评分的一致性为0.813（95%CI: 0.815-0.839），而免疫细胞评分的一致性为0.277（95%CI: 0.222-0.334）。
2016年德国进行了一项比较22C3、28-8、SP142和SP263在肺腺癌和鳞癌的染色模式研究。在15例手术切除标本的染色中，采用28-8和22C3单抗染色的标本中肿瘤细胞染色比例相似；相比之下，SP142在4例标本中的肿瘤细胞染色较少，SP263在9例标本中显示了更多的肿瘤细胞染色比例。
2017年同样评估这4种抗体一致性的蓝印计划（The Blueprint Project）开展，39例NSCLC标本的实验结果表明了当使用22C3、28-8和SP263分析时，染色的肿瘤细胞百分比是可比的，而SP142的检测结果显示染色的肿瘤细胞整体较少。
蓝印计划就是旨在探明不同免疫组化抗体检测肿瘤细胞PD-L1表达是否具有较高的一致率。
蓝印计划I期（Blueprint phase1，BP1）研究中对4个抗体（28-8、22C3、SP263和SP142）之间的一致性进行了评价。研究结果显示：28-8、22C3和SP263这三种抗体在肿瘤细胞PD-L1表达中具有较高的一致性；而SP142的敏感性较低，与其他三种抗体的一致性较差。
当然，蓝印计划 I期研究具有一定的局限性：首先所有的病例均是手术切除标本，而真实世界中需要检测的样本大部分为活检小标本，I期研究并未涉及；其次I期研究仅有三个病理医生参与PD-L1免疫组化的判读，从统计学上可信度不够。
蓝印计划II期A部分（BP2A）由25位经验丰富的病理医生进行评估，标本类型上除了手术切除标本以外，增加了穿刺标本和细胞学标本，在更大队列的临床实践标本中验证了上述蓝印计划1期的研究结果。
蓝印计划II期B部分（BP2B）邀请24位病理学家参与结果判读，包含的抗体有五个：22C3、28-8、SP142、SP263、73-10。纳入了31例病例，这些病例均包含有组织蜡块、空芯针或者钳夹活检以及细针穿刺细胞块包埋这三种配对标本；结果显示三种样本一致性较好。
德国一致性研究和蓝印计划在SP263同22C3、28-8单抗的可比性结论上有所出入，可能是样本量过少引起。同年，Ratcliffe等用22C3、28-8和SP263分别检测500个NSCLC的存档标本，设定肿瘤细胞胞膜阳性染色百分比包括1%、10%、25%和50%多个截断值作为PD-L1阳性标准，不同单抗之间的总体符合率均>90%。
综合以上结果可以发现，22C3、28-8和SP263的检测结果具有相似的肿瘤细胞阳性百分比，一致性较高，而SP142染色阳性的肿瘤细胞较少。
2 以22C3伴随诊断为例
以K药（帕博利珠单抗）为例，目前获批的适应症以及以22C3 作为伴随诊断时的判读标准。
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癌种 |
判读标准 |
临床意义 |
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非小细胞肺癌 |
PD-L1 22C3 TPS≥1% |
FDA批准帕博利珠单抗单药一线治疗肿瘤细胞表达PD-L1（TPS≥1%）、无EGFR和ALK基因变异，不适合手术切除或放化疗的Ⅲ期或转移性非小细胞肺癌患者 |
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宫颈癌 |
PD-L1 22C3 CPS≥1 |
FDA批准帕博利珠单抗用于治疗肿瘤细胞表达PD-L1（CPS≥1）的既往治疗疾病进展或化疗后难治性或转移性宫颈癌患者 |
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胃癌/胃食管交界腺癌 |
PD-L1 22C3 CPS≥1 |
FDA批准帕博利珠单抗用于治疗肿瘤细胞表达PD-L1（CPS≥1）的经过 2 种及以上治疗方案（包括氟尿嘧啶、含铂化疗）复发性局部晚期或转移性的胃或胃食管结合部腺癌 |
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头颈部鳞状细胞癌 |
PD-L1 22C3 CPS≥1 |
FDA批准帕博利珠单抗单药一线治疗肿瘤细胞表达 pd-L1（CPS≥ 1）的转移性或不可切除复发性的头颈部鳞状细胞癌患者 |
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尿路上皮癌 |
PD-L1 22C3 CPS≥10 |
FDA批准帕博利珠单抗用于治疗不适合含顺铂化疗且肿瘤细胞表达PD-L1（CPS ≥10），或不适合任何含铂类药物化疗的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者 |
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食管癌 |
PD-L1 22C3 CPS≥10 |
FDA批准帕博利珠单抗用于治疗复发性局部晚期或转移性食管鳞状细胞癌患者，这些患者PD-L1 表达为阳性（CPS≥10），经过一线或多线全身系统治疗后疾病仍然进展 |
**TPS：任何强度下显示部分或完全膜染色的肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比。
**CPS：PD-L1染色细胞(肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)计数除以所有肿瘤细胞计数再乘以100。
Ventana PD-L1检测判读标准解读
以Ventana SP263为例
在非小细胞肺癌（NSCLC）中，SP263 对肿瘤细胞（TC）的染色可呈现不同模式，包括基底和侧面膜染色、单纯基底膜染色以及细胞质围核染色（图 3），后者实际并未在胞膜染色，应从阳性 TC 中排除。
图3：SP263对TC的染色模式
Ventana SP263 对肿瘤细胞（TC）PD-L1 表达的评估方法为：有任何强度 PD-L1 膜染色的肿瘤细胞在所有肿瘤细胞中所占的百分比；但计分报道的 PD-L1 表达水平只能以十分位数和四分位数表示。
SP263 对免疫细胞（IC）的染色呈弥漫性特征，其评估应包括如下肿瘤区域内的 IC：①与肿瘤连续的周围基质，②肿瘤细胞群内基质，但需排除坏死区（图 4）；IC 种类包括淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞。
图4：肿瘤相关IC的评估范围
免疫细胞 PD-L1 表达的评分方法为：有任何强度 PD-L1 染色 IC 占总 IC 的百分比，同样只计分报道十分位数和四分位数。但与 TC 评估有所不同的是，若总 IC 为 1%，则计分报道的结果只能是 0%、＜100% 或 100%。
以Ventana SP142为例
SP142 检测需要使用一套扩增试剂，这导致其染色特征与其他克隆不同，即扩增后将呈现为点状或颗粒状染色。SP142 对于 NSCLC 的肿瘤细胞染色表现为环周膜染色或基底膜和侧面膜染色（图 5），均可以是粒状染色。
图5：肿瘤细胞的H&E染色及SP142 IHC染色
SP142 对 IC 的染色常表现出深棕色点状或线状染色，可能显示圆周染色，可分布在肿瘤内和/或肿瘤周围基质中，也可以是单细胞分布和/或聚集体。这一特性使 SP142 检测下，IC 的染色更为「突出」和易于辨认。
Ventana SP142 对 TC 和 IC 染色的评估和评分需采用逐步评分法，根据染色细胞的百分比各分为 4 个等级（图 6）。
图6：SP142 对肿瘤细胞和免疫细胞的逐步评分方法
值得注意的是，SP142 对 IC 染色的评分方法为：肿瘤区域内有任何强度 PD-L1 染色的免疫细胞所占面积的百分比。这可能对病理医生的判读过程造成一定难度，但通过对 Ventana 提供的典型染色切片及参考图像的学习，可以更好的掌握 SP142 对 IC 染色的评分。
3 影响检测结果的不同因素
对PD-L1检测准确性的要求不言而喻，然而同时也存在不同的方面对其检测结果产生影响。
A PD-L1表达的时空异质性
PD-L1表达的时空异质性表现为空间和时间两个方面。
空间异质性表现为PD-L1表达在同一肿瘤的不同位置可能不同，这种位置的异质性意味着穿刺部位不同导致PD-L1表达检测结果的不同。
空间异质性还表现为肿瘤转移到不同部位后PD-L1表达也不尽相同，如肾上腺和肝脏转移灶活检组织PD-L1表达通常比较高，转移灶位于骨骼或头颅时PD-L1表达比较低。
时间异质性表现为随着病程的延长，肿瘤PD-L1表达可能也会发生动态变化，这可能与先期治疗以及肿瘤生物学行为的动态演变有关。
此外，临床实践中还发现基因改变、组织学类型等因素也可能会影响PD-L1表达。总之，PD-L1表达的时空异质性较大，受多种肿瘤自身因素和外在变化的影响。
B 检测流程
所有影响免疫组化结果的因素均可以影响PD-L1检测结果。样本固定时间不足或过长会导致组织中抗原自溶或丢失，从而影响PD-L1表达结果。因此，在检测过程中做好阳性对照和阴性对照是很必要的。
目前PD-L1检测中，扁桃体和胎盘组织可分别作为阴性和阳性对照。PD-L1染色在扁桃体中呈现不同水平的染色：如在大多数生发中心巨噬细胞呈现弱到中等强度的点状胞膜染色，大多数上皮隐窝细胞呈现中等到强的染色，而大多数淋巴细胞(外套层和生发中心B细胞)和浅表上皮细胞无染色。
C 判读的主观因素
免疫组化指标的判读具有一定主观性，导致结果有所偏差，因此一定要加强标准的建立与人员的培训，尽量减少主观因素带来的误差。
PD-L1表达判读涉及到多个方面，如肿瘤细胞、免疫细胞、肿瘤细胞数量、阳性强度以及数量等。根据临床试验，不同肿瘤PD-L1判读的细胞不同。如肺癌仅判读肿瘤细胞，而胃癌、尿路上皮癌需要判读肿瘤细胞和肿瘤周围的免疫细胞。
一般来说，PD-L1判读至少需要100个肿瘤细胞。当组织样本中肿瘤细胞数量不足100时，应在报告中注明检测的肿瘤细胞数量，以供临床医生参考。
对于PD-L1的判读，只有细胞膜阳性才可以判读为PD-L1阳性，不论表达强弱。肿瘤组织内的巨噬细胞可表达PD-L1，不应将其判读为肿瘤细胞阳性。
另外，还要避免判读坏死的肿瘤组织，这些肿瘤细胞可能因为肿瘤抗原弥散而造成假阳性。切片边缘和挤压处出现的阳性不能作为PD-L1阳性。对于免疫细胞，需要判读淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等，而纤维母细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞等均不能计算在内。
PD-L1免疫组化结果判读，应首先观察HE染色切片，确定肿瘤细胞的数量及在切片中的位置；然后低倍镜下观察PD-L1免疫组化切片，确定PD-L1是否阳性以及阳性部位，最后高倍镜下仔细观察符合要求的PD-L1染色的肿瘤细胞及计算百分比。
对于手术切除标本，由于PD-L1表达存在异质性，此时可将切片划分为4个象限，分别计算每个象限的PD-L1阳性表达率，然后再平均即为该例肿瘤的PD-L1阳性表达率。
不同的评分标准:TPS vs CPS
肿瘤组织中，除了癌细胞，还有周围的间质细胞（如免疫细胞、内皮细胞、纤维细胞等）。因此，一份肿瘤组织标本染完色，着色的细胞既有可能是癌细胞，也有可能是其他细胞。那么，到底如何评判PD-L1的表达水平呢？
目前，有两大流派：
第一个是TPS流派，仅关心肿瘤组织中的癌细胞，仅计算癌细胞里被染色的比例，从而划分PD-L1的阴性、阳性以及出具PD-L1表达的比例；
另一个是CPS流派，不仅关心癌细胞，还关心周围组织里的免疫细胞，通过综合评估肿瘤组织里的癌细胞和免疫细胞被染色的强弱和比例，从而划分PD-L1的阴阳性。
目前绝大多数临床试验，均采纳的是TPS流派的观点；不过T药临床试验多数采纳的是CPS流派的观点。患者在拿到自己的PD-L1染色结果的时候，要善于分析到底是癌细胞还是免疫细胞上的PD-L1表达水平。
标本的年代:新鲜组织 vs 陈旧切片
标本是XX年前取得，还能用么？从原则上讲，标本当然是越新鲜越好；但是，总不能逼迫每一个晚期实体瘤患者，重新做穿刺活检甚至手术去获取最新鲜的标本吧。那么，新鲜的标本和陈旧的标本，到底有多大差异呢？
日本的 Hataji O教授对137份非小细胞肺癌标本进行了PD-L1染色，其中包括28份陈旧的标本（保存时间大于半年）和109份新鲜的标本（保存时间小于半年）。
结果显示：两者染色的结果相差很小。不过该研究纳入的标本数量较少，且以半年为界区分陈旧和新鲜，该结果还有待进一步确认。
在著名的入组了上***的Keynote001临床试验中，有足够的标本进行PD-L1染色的患者有1033人。其中455人是陈旧标本，578人是新鲜标本。
结果显示：陈旧标本中PD-L1表达超过50%的病人占40%；而新鲜标本中PD-L1表达超过50%的病人占45%。那些利用新鲜标本染色，结果呈现阳性的患者，接受K药治疗后，死亡风险的下降幅度更大、患者获益更明显。
因此，我们还是鼓励提供保存时间较短的新鲜标本进行检测，一般1-2年内的标本，是绝大多数临床试验可以接受的。保存时间更长的陈旧标本，很可能会鼓励重新取标本。
4 标本的大小：手术标本 vs 穿刺活检
还有一个经常被提及的问题，那就是是不是必须是手术切下来的大块组织，才可以送去做PD-L1染色，穿刺活检的小标本，会不会影响结果？
2018年西雅图的IzevbayeI教授研究发现，穿刺活检的小标本将会导致35%的病人PD-L1染色结果被误判。2019年，加拿大的Melosky B教授比较了手术大标本和细针穿刺的淋巴结小标本，分别进行PD-L1染色，结果提示：两者吻合率大约在90%左右。
因此，对于做过手术，有手术标本的患者，肯定是手术标本进行染色更靠谱；没有合格的手术标本的患者，拿穿刺活检的标本进行染色，也是一个目前看来可以接受的方式。
5 标本的形态：常规标本 vs 体液细胞块
不仅没有手术标本，连合格的穿刺活检的标本都没有；那么，能否抽血进行PD-L1染色呢？这个，毫无疑问肯定是不行的。免疫组化染色必须是在一个固态的玻璃片上进行；取外周血、尿等标本，肯定是行不通的。
不过，近年来，有专家尝试将胸水、腹水等标本中的癌细胞浓缩富集起来，然后固定在玻璃片上，再进行PD-L1染色。这种退而求其次的方法，是否可行呢？
法国的 Hofman P教授拿30例胸水浓缩而来的细胞块、40例支气管镜刷片的标本进行了PD-L1染色，结果发现80%以上的患者是可以获得PD-L1染色结果的，而且吻合率还行。因此，实在没有办法获得手术或者穿刺活检标本的患者；或许可以考虑胸水、腹水细胞块。下图展示了用Dako22C3对穿刺活检、胸水细胞块标本进行染色的结果：
小结
1、如何使免疫治疗药物在肿瘤治疗中更加精准仍然是研究的主旋律，目前PD-L1表达检测仍然存在一些问题，具体包括：检测技术方面，如不同的检测抗体、平台以及不同的阈值的问题；生物学方面，如肿瘤内和肿瘤间的异质性；
2、PD-L1作为标志物分析有效性最终是需要获得临床药物疗效的验证。同时，我们还应充分认识到，药物敏感性预测标志物需要在PD-L1之外进一步探索，肿瘤浸润性免疫细胞、肿瘤突变负荷（TMB）、dMMR/MSI-H、基因特征等都是筛选患者的指标。
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