表观遗传IVD检测专题报告3：表观遗传IVD成果转化于展望
1. 成果转化
表观遗传的科研成果向临床的转化道路漫长且费用高昂。在产品开发的最初过程中，除了上述所需要准备且经历的临床验证和资质申报等过程，拟议的IVD产品还必须提供比所带来的商业价值，以吸引成果转化所需的大量资金投入。除了产品与市场的契合度之外，知识产权的实用性，向投资人提供的临床证据的稳健性和质量，以及拟议市场中监管环境的性质都是吸引投资的关键因素。同时，为了让医学人士愿意接受实际应用，产品的实用性和临床依据必须要在经过同行权威评审的科学和医学杂志中发表，并在会议和研讨会上展示。本章节内容将针对知识产权（IP），以及如何为监管机构，投资人和医疗专业人员提供高质量的临床证据进行探讨。
1.1 知识产权
自2000年以来，表观遗传学领域的专利数量急剧上升，这主要是受到新型诊断技术和表观遗传技术专利的推动。专利权为公司提供了20年的独家使用biomarker的权利，并帮助生物技术和制药公司收回用于开发临床IVD产品的相关成本。例如通过授权使用，向实验室等机构收取费用。专利保护虽然对商业转化很重要，但也会阻止创新，因为它会阻止临床研究机构对流程的改进以提高biomarker的检测效率，如缩短检测时间，提高灵敏度或检测准确性等。在某些情况下，专利保护也会导致临床检测服务的垄断，从而导致定价过高并超出普通人群的承受范围。例如由Myriad提供的BRCA检测。长期以来，biomarker专利的社会和经济影响一直是哲学辩论的主题。2013年，法院针对美国分子病理学协会与Myriad Genetics公司之间专利诉讼的判决，和2012年针对Mayo Collaborative Services与Prometheus Labs诉讼的判决，让基于基因的诊断产品的专利申请在美国变得更加困难（Dreyfuss等。 在上述裁决中规定，基于生物相关的诊断方法不是新颖的，而是“自然法则”。
为了响应法院的裁决，生物制药行业寻求了新的策略来描述其知识产权的独特性和创造性。 如果在新的检测方法开发中更需要体现产品的新颖性和逻辑性，那么可以预期，美国的IVD诊断公司会将新颖的biomarker与新的（可专利的）检测方法相结合。而美国以外的公司可能会寻求在不适用法院判决的欧洲和/或亚太市场建立知识产权。对于寻求资金的较小公司而言，专利合作条约（PCT）一旦在全国实施之后，在美国专利商标局对关键专利要求没有进行明确解释之前，对PCT要求的有效性的不确定性可能使得在美国筹集资金更加困难。只有在收到专利审查员的评论后，才能确定IP投资的价值，然而这可能是在首次提交专利之后的数年。随着2019年5月美国宣布的两党，两院制法案草案（美国参议院，2019年）旨在改革《专利法》第101条，一些立法者现在正在寻求减少早期法院裁决的影响，并支持biomarker具有专利性。
1.2 监管
尽管有类似于含有10个成员辖区的国际医疗器械监管者论坛（IMDRF; http://www.imdrf.org）之类的机构正在努力实现有关IVD的全球监管统一，但在可预见的未来中，不同地区的监管仍将存在巨大的差异，这也将大大提高了检测分析的临床转化难度。 在转化过程中尽早考虑地理位置的优先级尤为重要，因为需要为监管机构量身定制适当的数据资料。对监管体系的深入分析已超出本报告的范围，但下面的内容将对美国和欧洲市场有关的注意事项进行简要总结和介绍。
在美国，存在三种不同的监管途径来获得FDA的IVD审批许可。510（k）监管途径适用于与现有的评断检测产品基本等效的新测试，而市场上没有经过评断的产品则应从头进行分类，以进行较低风险的检测，如果存在高风险，则应进行上市前批准（PMA）。 例如癌症诊断产品，如果产品是在指定实验室中针对医生采集的患者样本在“内部”进行的，则该检测可能会根据“自定”准则进行销售，该准则在美国被称为实验室开发检测（LDT）。目前，医疗保险和医疗补助中心（CMS）通过《1988年临床实验室改进修正案》（CLIA）对运行LDT的临床实验室进行管理。 CMS同时还可以批准其他认证方法，例如从州许可方案或其他组织，例如美国病理学家学院（College of American Pathologists, CAP））获得批准。 CLIA法规涉及实验室的标准，以及通过两年一次的调查以评估产品的分析有效性（准确度和精确度），并且实验室可以在评估之前开始分发检测结果。CMS的CLIA项目不涉及任何检测的临床有效性，即产品用以识别、检测或预测患者是否存在临床状况或倾向的准确性。FDA表示，由于其复杂性不断提高，打算对LDT加强监管（FDA，2014年）。 FDA指南显示出有意尽早引入LDT监管，对分析有效性进行更可靠的验证以及对临床有效性的要求。FDA还引入了高，中和低风险LDT的概念，无意监管低风险LDT，也无意满足未满足的需求或罕见疾病进行测试。而癌症诊断检测被归类为高危LDT，因此，无论选择PMA还是LDT途径，目前正在开发的诊断方法都应准备充足的证明分析数据和临床有效性。
在欧洲，于1998年制定了体外医疗器械指令（IVDD）98/79 / EC，以协调产品合格和评估程序的标准，并帮助建立统一的IVD泛欧市场。在欧洲上市的所有IVD都必须具有CE认证，代表该IVD设备符合IVDD。根据该法律，IVD制造商仅需自行声明该产品符合相关欧洲法律的基本要求。随着IVD市场的不断发展，欧盟委员会认为有必要进行修订。从2008年起开始进行公众咨询，新的《体外诊断医疗器械条例》（IVDR）（EU）2017/746出台，该立法于2017年5月26日生效，过渡期为五年，到2022年5月26日全面实施（欧洲议会，2017年）。当前受监管的IVD没有“继承“条款，因此所有现有的受监管IVD都需要再次进行CE认证。
IVDR与国际标准化组织（ISO）准则更加一致，并引入了基于风险的分类系统，并由公告机构加强监督。 这些类别基于“全球协调工作组”分类方案（IMDRF的前身），并确定了四个风险类别A-D，其中类别D为最高风险。用于癌症筛查，诊断和分期的IVD归类为C级，需要完整的质量管理体系。在单个卫生机构内进行和使用的“内部”测试不必符合IVDR，但它们要求实验室符合EN ISO 15189（医学实验室，质量和能力要求），并且卫生机构必须提供无商购的替代品证明，方能使用该产品进行检测。IVDR还要求遵守通用数据保护法规（GDPR），以将样品用于规定目的（欧盟，2018年）。为此，在临床试验的早期需要考虑是否遵守GDPR。与IVDD相比，IVDR对诊断产品的分析性能要求更高，其中包括对参考材料和方法的要求。
1.3 质量管理体系
任何寻求认证的IVD都需要提供质量管理体系（Quality Management System, QMS）证明，并遵守良好生产规范（Good Manufacturing Practice, GMP）要求。这为合格评定和持续的上市后责任（例如质量控制，外部质量保证和不良事件报告）提供了框架工作。 每个司法管辖区都有不同的合格评定程序。 考虑到全球协调性，IMDRF于2012年启动了医疗器械单一审核计划（MDSAP）。参与到MDSAP的监管机构为了协调接受度，并满足QMS和GMP的要求，要求审计机构可以对一家医疗器械制造商进行一次审计。
对于在美国提交的PMA，FDA需要确保产品存在合理的设计和生产监控，并有权进行批准前检查。在产品审批后8到12个月内，FDA还需进行审批后检查。然而LDT不必遵守FDA质量体系法规，也不必接受FDA检查。LDT（在其他国家/地区也称为“内部” IVD）是根据实验室网络的合规性进行监管的。许多国家已经将ISO 15189纳入其强制性医学实验室认证要求的一部分，但是在美国，对ISO 15189标准的认证不符合CLIA要求，并且不能替代基于CLIA的认证。与监管途径类似，转化管辖权的优先级应为质量管理体系的设计提供依据。现有标准也会随着时间而变化，并且会引入新的标准。与癌症诊断相关，有关“评估核酸靶序列定量方法性能的要求——qPCR和dPCR”的新ISO标准（ISO / FDIS 20395）正在制定中（国际标准化组织，2019年）。
在计划诊断测试的转化时，最为重要的是要为监管机构提供足够支持分析和临床有效性的合理技术设计及证据。 监管者还必须确信，该证据是从IVD的预期目标人群中收集的。 作为构建适当证据的指南，非营利组织临床和实验室标准协会（CLSI）制定了一套与诊断行业相关的指南。他们的“临床实验室测量程序的检测能力评估”指南文件旨在供IVD制造商，监管机构和临床实验室使用，为临床实验室测量程序的检测限的评估和记录提供指导（临床和实验室标准协会，2012）。
2. 展望
当前，在开发基于DNA甲基化的IVD产品中有众多新的突破和进展。随着GRAIL等公司不断证明cfDNA的甲基组测序比体细胞突变测序更能用于癌症的初步诊断，社会对这一领域的关注只会增加。新兴趋势是将更多的甲基化biomarker组合用于多癌检测和组织溯源。现有几项研究表明，cfDNA的甲基化状态可用于预测其来源组织，诸如EarlyDiagnostics等公司目前正在将这些技术进行转化。使用癌症基因组图谱（TCGA）数据设计的9223个CpG位点的大型血浆cfDNA组合已被证明能够高精度地检测常见晚期癌症和潜在癌症类型。与基准医疗（中国广州）合作的研究最近表明，一组9种亚硫酸氢盐测序扩增子可以高灵敏度检测血浆早期肺癌。
癌症IVD领域的另一个新兴趋势是基于多分析物检测，例如将体细胞突变检测和免疫测定相结合的CancerSEEK。最近，Guardant Health收购了Bellwether Bio，这将使他们能够在NGS ctDNA分析中纳入核小体定位和片段组学信息。最近发现基于cfDNA片段长度的一项研究（一种间接测量核小体定位的方法）具有良好的临床应用价值。
随着NGS成本的不断降低，使用全甲基基因组进行biomarker的发现变得越来越普遍。有了足够的受试者和测序深度，所有高实用性的biomarker都将被识别出来。一些正在开发的测试，例如用于膀胱癌检测的UroMark中150biomarker，就是基于全基因组测序的挖掘成果。
此外，在检测DNA甲基化状态方面有许多新的创新技术。两种新的基于酶的DNA转化方法，Enzymatic Methyl-seq和TET辅助的吡啶硼烷测序（TAPS）便是利用酶来转化DNA。相比亚硫酸盐的氧化处理，在温和的没处理条件下，可以提供更高的可扩增DNA的回收率，并且所得DNA无论是在靶向技术或是NGS技术中都可作为更优质的检测源。随着第三代测序技术的不断发展，为直接表观遗传检测提供了新的机会。为此，三个研究团队已经开始训练和测试了机器学习方法，以在牛津纳米孔技术MinION设备上检测甲基化DNA，并展现出良好的结果。但是，低样本量，片段短的cfDNA不是这些长片段阅读平台的最佳选择。利用物理化学特性直接检测甲基化DNA的新方法Methylscape也是一项令人振奋的创新，它为廉价的泛癌测试提供了潜在发展空间。
DNA甲基化IVD领域的持续技术发展和商业化行为不断加速，创造了一种快节奏、创新和竞争性的环境，这样的环境在未来中无论是在疾病早筛还是治疗效果中，都将为患者带来巨大收益。