胞嘧啶编辑器是什么？

胞嘧啶编辑器（CBE）在CRISPR/Cas9系统的基础上被开发出来，包含sgRNA和融合蛋白两个部分。将Cas9核酸酶的RucC和HNH两个功能域突变，产生突变型的dCas9（dead Cas9）或nCas9（nickase nCas9），然后将突变型Cas9、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子融合形成融合蛋白。胞嘧啶编辑器的工作原理是在sgRNA引导下，融合蛋白到特定的基因组位置上，然后胞嘧啶脱氨酶将C转变为U，然后U在DNA复制的过程中再转变为T（图1）。在这个过程中，尿嘧啶糖基化酶抑制子的作用是抑制中间体U的切除，提高T的转换率[1]。

图1. CBE的工作原理[1]

在第一代的胞嘧啶编辑器CBE1（rAPOBEC1-XTEN-dCas9）中，融合蛋白由来源于大鼠的rAPOBEC1（大鼠胞嘧啶脱氨酶）和dCas9组成[1]。其编辑活性窗口约为5个碱基，靶位点为第4－8位碱基。CBE1在体外具有较高的编辑效率，但是在哺乳动物体内的编辑效率则十分低下。经过研究人员的分析，这是可能由于DNA糖基化酶（Uracil DNA glycosylase, UDG）识别中间体UG，并通过碱基切除修复途径（BER）重新修复成CG。因此，抑制碱基切除修复途径能提高胞嘧啶编辑器的编辑效率。然后研究者们在rAPOBEC1-XTEN-dCas9基础上将尿嘧啶DNA糖基化酶（UGI）也融合其中，研发出第二代胞嘧啶编辑器CBE2（rAPOBEC1-XTEN-dCas9－UGI）[1]。CBE2展现出较高的编辑效率，最高可达到20%，比BE1高3倍。在实践的过程，由于CBE1与CBE2不会产生DSB，因此在基因组中发生非目标碱基插入、缺失和替换的概率极低。

但研究者们依然希望提高编辑效率，于是将dCas9替换成nCas9（Cas9 nickase nCas9 D10A），构建出第三代胞嘧啶编辑器CBE3（rAPOBEC-XTEN-nCas9（D10A）-UGI）[1]。nCas9具有切割非编辑DNA链（G所在的DNA链）的活性，能形成DNA单链缺口。然后细胞会启动碱基错配修复途径（MMR），以编辑链（含有编辑后U的DNA链）为模板进行修复（图2）。CBE3具有极高的编辑效率，比CBE2高2－6倍，但是CBE3除了能将C转变成T以外，还可能将C转变为G或A，并且还可能触发非同源修复机制（NHEJ）产生Indel。

为了进一步提高编辑效率，研发者在CBE3的基础上融合了第二个拷贝的UGI，同时优化rAPOBEC1、nCas9和UGI之间的接头长度，构建出第四代胞嘧啶编辑器CBE4（rAPOBEC-XTEN-nCas9（D10A）-2UGI）[2]。与CBE3相比，CBE4使得C到G和C到A基因编辑产物减少了2.3倍。并且在CBE4的基础上通过融合来源于噬菌体Mu的Gam蛋白或增加不同数量的核定位信号（NLS）以及使用不同公司优化的密码子序列等方法，降低NHEJ修复途径的发生，提高编辑效率。

图2. CBE的升级[1]