Nature子刊：单细胞层面探究疾病异质性的新思路

High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer高通量单细胞ChIP-seq识别乳腺癌染色质状态的异质性

一.研究背景

化疗耐药是癌症治疗过程中得一大难题，研究肿瘤内遗传异质性是解决肿瘤耐药性的关键因素，而单细胞测序可以深入研究肿瘤内的遗传异质性。但目前尚未发现驱动耐药的遗传机制，因此作者开发了一种scChIP-seq方法，从单细胞染色质景观中揭示细胞的身份，同时可通过通过H3K4me3（促进转录）和H3K27me3（抑制转录）区分染色质特征。

二.分析流程

三.结果解读

1.scChIP-seq微滴操作流程

  • 图1ab：scChIP-seq的操作流程

  • 通过细胞、核酸酶、裂解液和油滴组成single-cell封装；通过连接试剂、Barcode微滴和油滴组成封装。随后进行混合静置，得到核小体Barcode的微滴，随后进行免疫沉淀并测序。作者通过这种方法研究细胞内促进转录的核小体H3K4me3以及抑制转录的核小体H3K27me3的状态。

图S1. scChIP-seq具体操作流程

  • 图S5a：展示发生融合事件的信号，其中第一个液滴信号为没有Bead的细胞信号，第二信号为液滴融合的信号，第三信号液滴原本信号，第四个信号为bead和细胞的信号，第五信号为有bead液滴信号。作者通过实时监控控制测序信号的质量

  • 图S5b：展示了液滴中细胞荧光信号的强度（绿）和bead荧光信号的强度（红），以及可以精确得到合格样本的数量

  • 图S5c：统计H3K27me3和H3K4me3组蛋白修饰scChIP-seq实验的液滴数量，说明有约33%的样本可以用于进一步研究

图S5. 质量控制

  • 图S6a：作者为了确认每个液滴内核小体都源于一个细胞，作者对人类细胞和小鼠细胞混合后进行液滴封装，发现封装的液滴绝大多数有物种特异性

  • S6b：灰色为预计的封装数量；蓝色为小鼠细胞实际封装数量；红色为人类细胞实际封装数量；黑色为混合细胞封装数量

图S6. 验证scChIP-seq识别细胞的能力

  • 因此，通过融合、测序和质控三个步骤，作者得到了包括核小体和带有条码适配器bead的液滴

2.体外检测单细胞染色质景观

  • 作者对人Ramos细胞（B细胞）和Jurkat细胞（T细胞）进行了scChIP-seq实验

  • 图S7a：展示scChIP-seq测得每个bead上H3K4me3或H3K27me3不同信号强度细胞的数量

  • 图S7bc：通过对比B细胞H3K4me3或H3K27me3scChIP-seq多次实验的RPM，显示重复实验的RPM相关性良好，因此说明实验可重复

  • 图S7d：对H3K27me3scChIP-seq实验进行了t-SNE共识聚类，得到两个细胞簇

  • 图S7e：对1：1人B细胞和T细胞的混合物进行H3K27me3 scChIP-seq然后聚类，说明 scChIP-seq可以区分T细胞和B细胞

  • 图S7f：通过对比bulk ChIP-seq数据和scChIP-seq数据，有大量重叠数据

  • 图1b：tSNE分析H3K4me3和H3K27me3scChIP-seq数据，可将B细胞T细胞分成两类，且与原本的细胞分类对应

  • 图1c：H3K4me3和H3K27me3在B细胞和T细胞结合的区域

  • 图1d：scChIP-seq和bulk ChIP-seq数据相关性的分析，相关性程度高

  • 因此，scChIP-seq可以作为检测染色质状态单细胞测序方法，可以高度准确区分以及鉴定细胞群之间的区别。

图S7. 人B细胞与T细胞scChIP-seq实验

图1. scChIP-seq流程与B细胞T细胞验证

3.体内基质细胞中H3K27me3景观的多样性

  • 图2a：作者通过移植人类三阴性乳腺癌细胞到小鼠体内，构建移植瘤小鼠模型，然后通过卡培他滨治疗构建化疗耐药小鼠模型，并进一步将小鼠基质细胞与人类肿瘤细胞分离，然后进行H3K27me3 scChIP-seq、Bulk ChIP-seq和scRNA-seq。

  • 图S10a：通过PCA图确定最适合分类小鼠基质细胞reads的数量为1600

  • 图S10b：对所有样本进行共识聚类得到5个细胞簇

  • 图S10c：对每个细胞簇内部进行相关性分析

  • 图S10d：筛选细胞簇内相关性高的细胞，红色为scChIP-seq数据，黑色为外部数据，筛选出相关性高的数据

  • 图S10e：对图S10d筛选的数据进行进一步共识聚类

  • 图S10f：细胞簇数量从2到10的细胞内相关性分析，发现将细胞分成3簇平均相关性最好

  • 图S10g：对scChIP-seq所有细胞进行共识聚类，得到了3个细胞簇

图S10. scChIP-seq共识聚类具体方法

  • 图2b：作者对包括化疗敏感和化疗耐药小鼠基质细胞进行共识聚类，得到3种染色质不同的细胞：Chrom_c1，Chrom_c2和Chrom_c3

  • 图S11a：左图通过对比某一簇细胞与另外两簇细胞富集和耗竭区域的不同，进一步确定H3K27me3在每一类细胞结合的位置，中图和右图，通过GO富集分析在Chrom_c2和Chrom_c3细胞中H3K27me3耗竭的功能

  • 图S11b：左图展示Chrom_c2中H3K27me3耗竭位点，涉及Col3a1基因；中图和右图，对scChIP-seq和scRNA-seq进行Col3a1RNA或相关表达展示，在Chrom_c2区域中，Col3a1基因低表达，说明Chrom_c2和Chrom_c3群体具有特定H3K27me3富集的位点

图S11. 小鼠基质细胞scChIP-seq实验

  • 图2c：对化疗敏感和化疗耐药小鼠基质细胞的scRNA-seq 实验，作者得到了四个基质细胞群：其中两组为来源于成纤维细胞的细胞群（Col12a1和Efemp1标记）、一组内皮细胞群（Pecam1标记）和一组巨噬细胞群（Ms4a7标记）

  • 作者进一步对TSS上下游1kb的序列进行进一步研究

  • 图2d：在基因座Ptk2上，scRNA-seq细胞群Chrom_c1和3测得H3K27me3信号强，而在scRNA-seq实验中Ptk2基因座H3K27me3信号强的是成纤维细胞群

  • 图2e：在基因座Lmp上，scRNA-seq细胞群Chrom_c2测得H3K27me3信号强，而scRNA-seq实验中内皮细胞H3K27me3信号强

  • 因此，作者通过scChIP-seq实验获得小鼠基质细胞的三个与H3K27me3染色质相关的细胞群，并且其中两个和scRNA-seq实验测得的转录组特征匹配

图2. 构建耐药小鼠以及小鼠基质细胞scChIP-seq实验

3.乳腺肿瘤中染色质景观的异质性

  • 作者对从小鼠分离得到人类三阴性乳腺癌细胞进行研究

  • 图3abc：对人类三阴性乳腺癌细胞进行共识聚类（3a），然后通过tSNE分析，发现分类后的2个细胞群Chrom_c1（敏感）和Chrom_c2（耐药），且与化疗耐药分布相似。

  • 图S13a：展示了化学耐药人类三阴性乳腺癌细胞（HBCx-95-CapaR）与敏感细胞（HBCx-95）的拷贝数不同的区域，在chr15和chr18染色体上HBCx-95-CapaR拷贝数增加

  • 图S13b：通过scRNA-seq验证，共识聚类后主要依据化疗药敏性区分细胞群

  • 图S13c：确定了2个细胞群中细胞群间平均相关性最好

  • 图3d：所有细胞的 Consensus score Chrom_c2，其中得分越接近1则越有可能为Chrom_c2细胞群，发现有少数 HBCx-95细胞得分高，可能与化疗耐药有关

  • 图3e：通过火山图对比Chrom_c2和Chrom_c1，得到在Chrom_c2中染色质中有569个区域H3K27me3下调，114个区域H3K27me3上调

  • 图3f：展示所有染色质分布不同区域中，基因的情况，其中有34个基因被scRNA-seq验证在两种细胞群中有区别，其中在Chrom_c2中有两倍变化的基因为：上调基因DMKN、PDE4A、COL4A2、TMEM176B和IGF2BP3；下调基因C1orf21。

  • 图3ghi：在耐药相关基因（IGF2BP3）和EMT相关基因（COL4A2和HOXD）的基因座上Chrom_c2的H3K27me3信号弱，同时使用scRNA-seq验证。说明Chrom_c2细胞群中耐药基因与EMT相关基因高表达

图S13. 人三阴性乳腺癌细胞scChIP-seq实验结果

图3. 三阴型乳腺癌染色质景观

4.在未经治疗的肿瘤中检测到“抗药性”染色质亚克隆

  • 作者又进行了雌激素受体阳性的乳腺癌小鼠移植瘤耐药模型（HBCx-22和HBCx-22-TamR）进行验证

  • 图4a-d：使用HBCx-22和HBCx-22-TamR重复图3a-f实验，可以通过染色体特征分成两个细胞聚类（图4ab），同时有部分未经治疗HBCx-22显示出Chrom_c2高得分，可从HBCx-22中筛选出化疗耐药的细胞（图4c），统计了两种亚型染色质分布不同区域的数量，以及筛选出染色质分布不同的含有TSS区域的基因为EGFR、IGFBP3和ALCAM

  • 图4e-g：使用scRNA-seq检测基因差异情况，对scRNA-seq检测结果进行分类（图4ef），展示scRNA-seq分类细胞的通路情况，RNA_c6簇（HBCx-22来源）显示出耐药通路的激活和基底样基因标记的激活（图4g）

  • 图4hi：展示了基因EGFR与IGFBP3的染色体状态与转录物状态，两种检测方法都显示在HBCx-22部分细胞存有化疗耐药性

  • 因此，通过两种检测方法，可以检测到化疗敏感肿瘤细胞中存在耐药细胞，同时展示了耐药细胞转录组和染色质水平的非遗传特征。

图4.. 雌激素受体阳性乳腺癌scChIP-seq实验结果

小结

最后小结一下，在这篇文章中，作者首先介绍了scChIP-seq的工作流程，然后通过人类的B细胞与T细胞进行验证scChIP-seq的分类准确性。随后，作者构建小鼠化疗耐药模型，分离了小鼠基质细胞和三阴乳腺癌细胞，进行scChIP-seq和scRNA-seq，发现三阴乳腺癌细胞通过scChIP-seq实验并共识聚类后的细胞群与耐药分布相似，且部分未经治疗的化疗敏感细胞和耐药相关，而小鼠基质细胞则没有这个结果。最后，作者通过雌激素受体阳性的乳腺癌小鼠移植瘤耐药模型，进一步验证了结论，可从未经治疗的化疗敏感细胞中找出耐药细胞。

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