自建队列简单分析发7+分思路

Comprehensive RNA Sequencing in Adenoma-Cancer Transition Identified Predictive Biomarkers and Therapeutic Targets of Human CRC腺瘤-癌转移的全面RNA测序确定了人类CRC的预测生物标志物和治疗靶标

一、研究背景

结肠癌(CRC)是全球第三大常见癌症,在中国发病率和死亡率不断增加。对于结肠癌的发生,从腺瘤向癌的转变被认为是至关重要的,这之中还包括多种遗传和遗传表观遗传学危险因素。近几年,研究人员发现高达90%的CRC病例经历了从腺瘤向癌的转变这一过程。因此,不少人认为这一发现为早期筛查和预防CRC提供了机会。

二、研究流程

三、结果解读

1、候选circRNA,miRNA和mRNA的表达谱

图1.RNA的鉴定和层次聚类分析

图S1. RNA重叠的Venn图

在邻近的正常组织和腺瘤组织中,作者鉴定出575种差异表达的circRNA(DEC),243种差异表达的miRNA(DEM)和3,950种差异表达的mRNA(DEG)。而在邻近的正常组织和癌症组织,仅有 171种DEC,53 种DEM和506种 DEM。(如图1A-1F)

紧接着,作者通过层次聚类分析探索了各组之间共同表达的RNA的表达模式。与邻近的正常组织相比,大多数共同表达的RNA在腺瘤和CRC组织中表现出相似的表达模式(图1G-1I)。

2、功能富集和PPI分析

图2.候选DEG的功能富集

图3.候选DEG的PPI网络

为了探索共同表达的DEG的主要生物学功能,作者进行了GO和KEGG通路富集分析。作者发现在前30个富集的GO terms和KEGG途径中(图2),基因沉默的调节,DNA损伤检查点,细胞周期,p53信号通路等都与肿瘤发生有关。

紧接着,作者通过PPI分析来确定共同表达的DEG中的重要中枢基因,并生成了具有301个节点的网络(图3A)。同时,作者发现总共有180个基因(例如CASP8,TNS1,CXCL1等)与五个以上的其他基因相互作用。然后作者使用CytoNCA来计算每个节点的程度,图3B中显示了具有前50个基因的子网。

3、 miRNA-mRNA相互作用和circRNA相关的ceRNA网络分析

图4. miRNA-mRNA调控网络和与circRNA相关的ceRNA网络

为了构建与circRNA相关的ceRNA网络,作者首先对负调控的miRNA-mRNA对进行了筛选和可视化,接着构建了具有24个下调的miRNA和158个上调的mRNA的网络(图4A)。不仅如此,作者还生成了另一个具有17个上调的miRNA和86个下调的mRNA的网络(图4B)。紧接着,作者又使用starBase预测了miRNA与circRNA之间的相互作用,并构建了一个ceRNA网络(图4C)。

4、TCGA数据库和real-time PCR验证

图5.代表性的RNAs表达验证

为了验证该发现,作者将ceRNA网络中的RNA表达水平与TCGA数据库进行比较,并通过real-time PCR进行验证。作者发现六个下调的mRNA和两个上调的miRNA的表达模式与TCGA数据一致(图5A-5H)。接着,作者又通过real-time PCR在结肠腺瘤和癌组织中验证了另外10个差异表达的RNAs(图5I和5J),发现RNA测序和real-time PCR结果一致。

5、ROC曲线分析

图6.三种circRNA的ROC曲线分析

作者通过real-time PCR验证了三个circRNA(hsa_circ_0049487,hsa_circ_0066875和hsa_circ_0007444)在ceRNA网络中的表达水平。作者通过文献检索发现ceRNA网络中与circRNA相关的miRNA和mRNA可能在癌症进展中起作用,这一发现提示了作者上述三种circRNA在癌症中可能存在潜在的作用。因此,作者采用ROC曲线分析来评估候选circRNA在结肠腺瘤和CRC中的诊断价值。结果如图6A-6B所示。该结果表明,上述三种circRNA在结肠腺瘤和癌症中有着良好的诊断价值,因此可以作为预测CRC的早期生物标志物。

小结

本文中,作者通过全面的RNA测序获得了邻近正常组织,结肠腺瘤和CRC组织的circRNA,miRNA和mRNA表达谱,紧接着又通过关注在结肠腺瘤和CRC中通常发生变化的RNA来确定几种候选物。但是,作者的研究也存在一些缺陷。首先,作者的数据基于RNA测序表达谱,还需要明确cirRNA相关的ceRNA的潜在功能和机制。其次,这项研究的临床样本数量有限,需要更大规模的验证来验证这些发现。总而言之,作者的发现阐明了从恶变前腺瘤向癌症转变的机制,鉴定了与circRNA相关的特定信号。这可能提供一个新颖的观点,并可能用于CRC的早期诊断和潜在的治疗靶点。

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