流式细胞术的样本制备方法

流式细胞术的样本制备和染色方法是进行流式分析的基础，虽然是基础，但是样本制备可并没有那么容易，比如细胞数目的掌握很难，过于稀释浓度不够，过于稠又会在通过细胞仪时影响分析，做不出结果，这是我们做流式的一大通病，特别是从组织中分离样本时，这样的问题常常遇到。

　　今天，我们就看看如何从不同组织中分离出优质样本。

　　与贴壁或者悬浮细胞相比，组织样本的单细胞制备相对有一定的难度和复杂性，也是同学们最容易出现问题的地方，如细胞数量太少，细胞活性不好，细胞碎片太多等。下面就具体看看组织中的细胞如何制备。

　　目前，最常用两种方法是物理法和酶解消化法。

　　一、 物理方法：

　　原理：是指利用物理方法(机械法)分散组织，经过滤网过滤获得单细胞悬液。

　　应用：常用于处理部分软组织例如骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结等，或富含细胞的肿瘤组织----淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及一些软组织肉瘤等，用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞。

　　优势：操作方便，耗时短，且能获得大量的细胞。

　　缺点：易造成组织细胞机械损伤，如细胞碎片和细胞团块，所以常与其他方法配合使用;对硬组织或纤维组织效果不好。

　　操作步骤：

　　1. 吹打：用移液枪或注射器反复吹打组织以获得单个细胞的方法。应用于：骨髓、腹腔、肺等组织中相对比较游离的细胞(骨髓、巨噬细胞等)。

　　2. 剪碎研磨法：用锋利的剪刀将组织剪碎后，并研磨以获得单个细胞的方法。应用于：脾脏、淋巴结、胰腺等新鲜组织。

　　3. 网搓法：用100-300目的尼龙滤网固定于烧杯口，组织在网上轻搓，可用此法获得单个细胞的方法。常应用于：正常的组织、瘤组织、淋巴结等标本。

　　二、酶解消化法：

　　原理：利用酶(主要是胶原酶和蛋白酶)破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等、水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞的方法。

　　应用：既可用于普通单层的传代细胞也适合致密的组织样本，如上皮、肝、肾等或含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等。

　　优势：适用于大部分组织样本获取单细胞，酶的种类多选择空间大。

　　缺点：操作步骤比较繁琐，消化时间比较长且难控制。不同的组织样本酶种类、浓度、消化时间的选择需要不断摸索优化。