华南师大王璋、广东省中医院黄清春、黄闰月等揭示痛风患者肠道菌群特征

npj Biofilms and Microbiomes：华南师范大学王璋、广东省中医院黄清春、黄闰月等揭示痛风患者肠道菌群特征

宏基因组分析揭示了肠道菌群在痛风中的潜在作用

Metagenomic analysis revealed the potential role of gut microbiome in gout

npj Biofilms and Microbiomes [IF: 7.29]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41522-021-00235-2

发表日期：2021-08-09

第一作者: Yongliang Chu(储永良)^1,2,12，Silong Sun^1,3,12 ，Yufen Huang^3,12，Qiang Gao^1,4,12，Xuefeng Xie^5,12，Peng Wang^3,12

通讯作者：Qingchun Huang(黄清春)([e-mail])¹，Zhang Wang(王璋)([e-mail])¹¹，Runyue Huang(黄闰月)([e-mail])^1,7,9

合作作者: Peng Wang,Junxia Li, Lifeng Liang, Xiaohong He, Yiqi Jiang, Maojie Wang, Jianhua Yang, Xiumin Chen, Chu Zhou, Yue Zhao,Fen Ding,Yi Zhang,Xiaodong Wu,Xueyuan Bai, Jiaqi Wu,Xia Wei,Xianghong Chen,Zhen Yue,Xiaodong Fang

主要单位：

¹广州中医药大学第二附属医院(State Key Laboratory of Dampness Syndrome of Chinese Medicine, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine), Guangzhou, China)

⁷广东省中医证候临床研究实验室(Guangdong Provincial Key Laboratory of Clinical Research on Traditional Chinese Medicine Syndrome, Guangzhou, China)

⁹广州中医药大学粤港澳中医药与免疫疾病研究联合实验室(Guangdong-Hong Kong-Macau Joint lab on Chinese Medicine and Immune Disease Research, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, China)

¹¹华南师范大学生命科学学院(Institute of Ecological Sciences, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou, China)

摘要

肠道微生物组与关节炎疾病(包括痛风)之间存在关联。但是，痛风患者的肠道细菌种类及其影响痛风患者尿酸盐降解和引发炎症的机制仍不清楚。在本研究中，作者对102名痛风患者和86名健康对照者的307份粪便样本进行了宏基因组分析。结果发现，痛风患者与健康对照组的宏基因组有显著差异。具体表现为痛风患者中普氏杆菌(Prevotella)、梭杆菌(Fusobacterium)和拟杆菌(Bacteroides)的相对丰度增加，而肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和丁酸盐产生菌的相对丰度减少。从功能上讲，痛风患者的果糖、甘露糖代谢和脂质A生物合成基因丰度较高，尿酸降解和短链脂肪酸生成基因丰度较低。结合临床数据分析得到肠杆菌科物种丰度的降低与氨基酸代谢和环境感知的降低有关，这两者共同导致痛风患者血清尿酸和C反应蛋白水平升高。基于三个肠道微生物基因的随机森林分类器在发现和验证队列中对痛风病症具有较高的预测性(准确度为0.91和0.80)。纵向分析表明，治疗24周后，降尿酸和抗炎药恢复了部分肠道微生物群。与肥胖、2型糖尿病(T2D)、强直性脊柱炎(AS)和类风湿性关节炎(RA)的对比分析表明，与代谢性疾病相比，痛风的宏基因组跟自身免疫性疾病的相似度更高。该研究揭示了肠道生态失调与宿主尿酸盐降解和全身炎症的失调有关，可作为痛风的非侵入性诊断标志物。

引言

痛风是一种炎症性关节炎疾病，主要累及关节，被认为是高血压和心血管疾病的危险因素。痛风在男性中更为常见。由于饮食和生活方式的改变，痛风的患病率逐年攀升。2015-2016年，美国报告的痛风患病率为3.9%，而2003-2014年，欧洲国家的痛风患病率介于1%和4%之间。对30项研究的荟萃分析显示，2000-2016年，中国大陆的痛风患病率约为1.1%。尽管中国痛风患病率相对较低，但但呈逐年上升趋势。

痛风主要由尿酸异常增加和尿酸单钠(MSU)结晶引起。健康人群有两种途径从体内排出尿酸：肾脏，负责排出70%的尿酸；肠道，排出剩余的30%。最近的研究表明，肠道微生物群失调与关节炎疾病有关，包括强直性脊柱炎(AS)，类风湿性关节炎(RA)和银屑病，但肠道微生物群与痛风之间的关系仍不明确。先前的一项研究表明，粪拟杆菌(Bacteroides caccae)和木糖降解拟杆菌(B. xylanisolvens)在痛风患者中显著富集，而普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii )和假链状双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)的丰度降低。痛风患者的肠道微生物功能，包括嘌呤代谢也发生了改变。另一项结合微生物组学和代谢组学的研究显示，痛风患者拟杆菌属(Bacteroides)，卟啉单胞菌科(Porphyromonadaceae)，红球菌属(Rhodococcus)，丹毒荚膜菌属(Erysipelatoclostridium)和无气荚膜菌科(Anaerolineaceae)中的条件致病菌增加，同时尿酸排泄和嘌呤代谢的代谢物发生改变。尽管这些研究有深刻的见解，但大多数研究的样本量都很小，没有或只有少数样本进行独立验证，因此它们的普适性受到限制。并且肠道微生物群与痛风相关临床参数之间的关系，以及肠道微生物群对痛风治疗干预措施的反应尚不清楚。因此，对于肠道微生物如何以及哪些可能影响痛风的关键病理生理过程(如宿主尿酸盐降解和全身炎症)缺乏全面的观点，需要在进一步的纵向研究中对患者临床参数进行详细描述。

在这里，作者对从痛风患者和健康对照组纵向采集的307份样本的肠道微生物组进行了宏基因组分析。利用发现和验证队列，作者研究痛风患者肠道微生物组的分类和功能特征，这些微生物与痛风相关临床参数的关联，如血清尿酸(SUA)和炎症，及其对治疗干预的反应。痛风相关的微生物群特征与更广泛的自身免疫和代谢紊乱有关。

主要结果

痛风患者和对照组的肠道宏基因组概述

Overview of gut metagenome in gout patients and controls

作者对从188名个体收集的307份粪便样本进行了宏基因组测序。2016-2017年间，发现队列中收集了140个样本，包括77名痛风患者和63名健康对照。2018年收集的验证队列中有48个样本，包括25名痛风患者和23名健康对照。此外，在三个随访时间点(基线后第2周、第4周和第24周)，从发现队列中的痛风患者纵向收集70、40和9个粪便样本，以评估治疗干预对痛风患者肠道微生物群的影响。与对照组相比，痛风患者的炎症水平和肾脏指数，包括C反应蛋白(CRP)、血沉(ESR)、尿酸和血清肌酐(SCr)水平升高。

与健康对照组相比，痛风患者的微生物基因丰富度和多样性均较低(图1a-c)。肠型是解释样本肠道微生物组成变异性的主要因素。然而，痛风患者和对照组之间的肠型分布无显著差异。β多样性分析显示，痛风组和对照组样品之间的微生物群落差异比各组样品之间的差异有小而显著的增加(图1d)。在发现和验证队列中，肠道微生物成分与痛风之间存在显著关联(图1e)。这些结果表明，当考虑肠型时，疾病状态成为与肠道微生物群相关的一个主要因素。在所有可能影响肠道微生物组的人口统计学因素(年龄、BMI、饮酒、益生菌使用、素食)中，痛风患者和健康对照组之间只有BMI存在显著差异，因此在统计分析中将其作为混杂因素。MaAsLin分析表明，地嗜皮菌(Geodermatophilus)与BMI相关，帕拉伯克霍尔德属(Paraburkholderia)和嗜组织菌(Histophilus)与饮酒相关，Varibaculum、Dakarella和Suterrella与益生菌相关。其中，只有Sutterella在痛风患者和对照组之间存在差异，表明其与痛风的关联可能归因于是否使用益生菌。

图1 痛风患者的肠道微生物变化

a 在健康对照组和痛风患者中基于Chao2估计基因计数的基因稀释曲线；

b 健康对照组和痛风患者基因计数的箱线图；

c,d 基因水平上α多样性(Shannon index)和β多样性(Bray-Curtis distance)的盒状图和须状图；

e 基于基因相对丰度分布的主成分分析(PCA)；

f-i 拟杆菌(Bacteroidetes)/厚壁菌(Firmicutes)的比率，痛风患者组和健康对照组之间差异门(g)、属(h)和种(i)的相对丰度。

痛风患者肠道宏基因组的物种变化

Taxonomic alternation of gut metagenome in gout

接下来，作者确定了与痛风相关的肠道微生物类群。在发现队列中(n = 140)，共鉴定出18门、415属和861种细菌。在门水平上，类杆菌(Bacteroidetes)和梭杆菌(Fusobacteria)丰度上升，而变形杆菌(Proteobacteria)下降(图1g)。痛风患者类杆菌(Bacteroidetes)与厚壁菌(Firmicutes)的比例较高(图1f)。在痛风患者和对照组之间有110属223种的数量存在显著差异(图1h、i)。

痛风患者肠道宏基因组的功能变化

Functional alternation of gut metagenome in gout

主成分分析(PCA)显示，与对照组相比，痛风患者的肠道微生物功能显著改变。先前的研究表明，痛风患者的肠道微生物群与尿酸盐降解失调有关。此研究中，健康对照组的与尿酸盐降解相关的基因丰度较高(图2a，b)，主要微生物来源是肠杆菌科(Enterobacteriaceae
spp)(图2c)，其中克雷伯氏菌属(Klebsiella)与尿酸盐降解KOs的相关性最高。此外，SUA与肠杆菌科和雷伯氏菌属呈负相关(图2d)。这些结果表明肠杆菌科(Enterobacteriaceae spp)细菌可能参与肠道内尿酸的降解，并维持人体内尿酸的稳定性。

图2 痛风相关微生物基因功能与尿酸盐降解有关

a 用于尿酸盐降解的KEGG模块；

b 参与尿酸盐降解的KOs的相对丰度；

c 痛风相关属和尿酸盐降解相关KOs之间的相关性(红色和紫色分别表示正相关性和负相关性)；

d SUA与肠杆菌科(Enterobacteriaceae spp)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)之间的关系。

与痛风临床数据相关的肠道宏基因组分析

Gut metagenome associated with gout clinical parameters

接下来，作者试图了解哪些肠道微生物分类群和功能与痛风患者的临床参数相关。作者对微生物种类、功能和临床参数进行了相关性分析(图3)。与PERMANOVA一致，SUA和CRP与微生物种类和功能途径的相关性最强。SUA与25种痛风富集物种呈正相关，而与22种对照富集物种呈负相关，其中20种属于变形杆菌(Proteobacteria)。CRP与40种痛风富集物种呈显著正相关，与38种对照富集物种呈负相关。变形杆菌，特别是肠杆菌科(Enterobacteriaceae spp)的变形杆菌(Proteobacteria)，与氨基酸代谢、苯甲酸降解和细胞运动(即鞭毛装配和趋化)的途径呈正相关，与SUA和CRP呈负相关。相反，厚壁菌(Firmicutes)和拟杆菌(Bacteroidetes)中富含痛风的物种与富含痛风的功能途径(如碳水化合物代谢、能量代谢和脂质A生物合成)表现出中度相关性。这些结果表明，肠杆菌科(Enterobacteriaceae spp)物种丰度的降低可能导致氨基酸代谢和环境感知功能的降低，共同导致痛风患者的尿酸增加和全身炎症。

图3 细菌种类、KEGG途径和临床参数的关联热图

利用肠道宏基因组基因对痛风进行分类

A classifier using gut metagenomic genes for gout

痛风患者和健康对照组之间明显的微生物差异启发作者研究肠道微生物组是否有可能区分痛风患者和健康对照组。利用发现队列中的随机森林模型，基于微生物基因水平剖面构建疾病分类器。疾病分类器包括前100个差异丰富的基因。在基于10倍交叉验证的特征选择后，三个基因(基因ID:15049[外显α唾液酸酶]、415936[N-6 DNA甲基化酶]、1697136[松驰酶/动员核酸酶域含蛋白质])以最佳性能保留，在此基础上建立了分类模型(图4a)。作者发现队列中痛风患者的所有三个基因均显著富集(图4b)，其中两个(15049和415936)在验证队列(FDR)中显示出增加趋势(图4c、d)。为了评估这些标记物的痛风特异性，作者检索了AS(n = 211)，RA(n) = 169），T2D(n = 268)和肥胖(OB，n = 200)，使用相同的管道处理这些数据集，并评估三个基因在患者和对照组之间的辨别能力。这些队列中的AUC范围在0.50-0.54之间，表明这三个基因特征具有痛风特异性(图4e)。

图4 痛风的肠道宏基因组分类器

a 利用发现队列中微生物基因的相对丰度对模型进行训练。所有微生物基因首先根据其可变重要性进行排序，然后依次添加到模型中。在随机森林分类中，随着基因数量的增加，绘制了5个10倍交叉验证试验的误差曲线；

b 发现和验证队列中三种微生物基因标记的相对丰度；

c 发现样本的受试工作曲线(ROC)；

d 验证样品的ROC；

e 痛风的ROC和使用三种痛风相关基因标记的强直性脊柱炎(AS)、肥胖(OB)、风湿性关节炎(RA)和2型糖尿病(T2D)的四个公共病例对照宏基因组数据集。

降低尿酸和抗炎干预对痛风患者肠道宏基因组的影响

Effect of uric-acid-lowering and anti-inflammatory interventions on gut metagenome in gout

先前的研究已经证明了治疗药物对肠道微生物群的影响。作者评估了接受治疗干预的痛风患者(2周，n = 61)，4周(4W，n = 38)和24周(24周，n = 7)。大多数患者接受了降尿酸和抗炎药治疗。在药物干预期间，主坐标分析(PCoA)显示，24周时的样本与其他患者样本分离，更接近健康对照组(图5a)。同样，与2周或4周时的样品相比，24周时的样品与基线样品的Bray–Curtis差异显著更大(图5c)，表明干预在24周时对肠道微生物群的影响更大。考虑到不同时间点不匹配的样本量可能会使结果产生偏差，作者选择了五名痛风患者，他们的粪便样本在所有四个时间点采集，结果与使用所有样本的分析结果一致(图5b)。与基线相比，22种细菌物种(包括9种富含痛风的物种)的丰度在24周时降低，而8种细菌物种(包括2种对照富集的物种)的丰度增加(图5d)。在功能上，痛风患者与对照组在基线检查时发生显著改变的10条KEGG通路在24周时显示出明显的逆转趋势(图5e)。这些结果表明，在治疗24周时，降低尿酸和抗炎药物可能会部分恢复肠道微生物。

图5 痛风治疗干预后肠道微生物群的变化

a 基于治疗前后健康对照组和痛风患者基因水平上Bray–Curtis距离的PCoA图；

b 基于健康对照组和五个时间点配对痛风患者基因水平上的Bray–Curtis距离的PCoA图；

c 痛风患者治疗前后β多样性的盒须图；

d 治疗24周后，细菌种类的相对丰度受到调节；

e 治疗后微生物基因功能发生改变。

痛风与其他自身免疫和代谢性疾病肠道宏基因组的比较

Comparison of gut metagenome between gout and other autoimmune and metabolic disorders

为了在更广泛的慢性疾病背景下更好地理解肠道微生物在痛风中的作用，作者使用公共病例对照宏基因组数据集，比较了痛风与AS、RA、T2D和OB的肠道微生物特征，其中前两种是自身免疫性疾病，后两种是代谢性疾病。与其他四种疾病相比，痛风患者的整体肠道微生物失调程度处于中等水平(图6a)。然后交叉比较每个数据集中的病例对照比较中获得的不同细菌种类和基因家族，以评估每种疾病的微生物分类和功能特征。就分类特征而言，痛风与AS患者最为相似，共有40个相似物种(图6b)。对于微生物功能，痛风与RA和AS聚集在一起(图6c)。这些结果证明痛风的失调特征可能更类似于自身免疫性疾病而非代谢性疾病，这意味着肠道微生物群可能对自身免疫性疾病的发展产生共同影响。然而，肠道微生物群在自身免疫性疾病中如何与宿主相互作用尚不清楚，需要进行相关的机理研究。

图6 痛风与其他自身免疫和代谢性疾病之间肠道微生物组的比较

a 在每个AS (n = 211)、痛风(n = 140)、OB (n = 200)、RA (n = 169)和T2D (n = 268)数据集的病例对照比较中，所有微生物基因的Wilcoxon秩和检验的P值分布；

b AS、痛风、OB、RA和T2D中不同物种的比较；

c AS、痛风、OB、RA和T2D中微生物基因功能的比较。

结论

作者确定了与痛风相关的肠道微生物组的分类和功能特征，并根据分析结果提出了肠道微生物如何影响痛风发展的假设模型。痛风时类杆菌(Bacteroides)和普氏杆菌(Prevotella)中的物种比肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的物种丰富，可能导致六个酰基链脂质A的生物合成改变为四个或五个酰基链的脂质A，并且共同在宿主免疫刺激和内毒素耐受方面表现出负效应。同时，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌种类的减少可能导致尿酸降解功能障碍，从而导致痛风患者体内尿酸累积增加和炎症。其他微生物功能，如SCFA产生和鞭毛组装，可能有助于维持健康的肠道微环境，痛风中SCFA的消耗可能通过改变宿主受体导致局部和全身炎症增加。本研究结果显示痛风患者肠道微生物群的失调与SUA增加和全身炎症有关，随着时间的推移，通过降低尿酸和抗炎药物干预可能会部分恢复。未来需要对更大的纵向队列进行多组学研究，以及进行动物模型实验验证，从而更好地理解痛风肠道微生物群的潜在机制。

第一作者简介

第一作者：储永良，副主任医师，医学硕士，广东省中医院珠海医院风湿血液科主任，硕士生导师，国医大师李济仁学术传承人。现主研省级课题2项，参研国家自然科学基金项目1项，在国内国际学术期刊发表20余篇，参编医学著作4部，其中副主编一部。兼任广东省基层医药学会风湿病分会副主委，珠海市医师协会血液风湿病分会副主任委员等职务。

通讯作者

黄清春，广东省中医院风湿科主任，主任医师，博士研究生导师，博士后合作导师。擅长于中西医结合治疗强直性脊柱炎、类风湿关节炎、痛风等风湿病，获得临床和科研的业界认可。主持国家和省自然科学基金等25项，在国内国际学术期刊发表论文80余篇，其中SCI文章12篇。牵头制定国家中医药管理局皮肌炎、硬皮病临床指南。参与中华中医药学会类风湿关节炎和骨关节炎的指南制定。主持和参与编写出版医学专著8部。兼任广东省中医药学会风湿病专业委员会主任委员，广东省小区卫生学会风湿与康复分会会长，中华中医药学会风湿病分会副主任委员，中华中医药学会免疫学分会副主任委员，世界中医药联合会中医药免疫专业委员会副会长兼副秘书长等职务。

黄闰月，中西医结合临床医学教授，主任医师，博士研究生导师，博士后合作导师，现任广东省中医院风湿免疫研究团队PI，主持及参与国家自然科学基金、省部共建国家重点实验室、教育部粤港澳联合实验室、省科技厅及省重点实验室项目等研究课题多项，至今相关产出包括在国内国际学术期刊发表论文40余篇，其中SCI论文27篇，获批或申报专利7项，出版专著1部，参编中华中医药学会《中医内科临床诊疗指南》2部，参加科技部十三五重大项目1项，获得中华中医药学会科技进步奖二等奖1项。入选“广东特支计划科技创新青年拔尖人才”、“广东省杰出青年医学人才”、“广东高校优秀青年教师培养计划”、“珠江科技新星”、“广东省百名博士博士后创新人物”以及“中华中医药学会青年人才托举工程”等多项省市及学会人才项目。担任中华中医药学会免疫学分会青年委员会副主任委员、广东省中医药学会风湿病专业委员会副主任委员、岭南中医抗风湿联盟秘书长等职务；担任《Frontiers in Pharmacology》副主编与“传统医学与风湿病”专栏的特约编辑、《Journal of Leukocyte Biology》中华中医药学会免疫分会特刊编辑、《中国中西医结合杂志》等评审库专家。

王璋、华南师范大学生命科学学院研究员，广东省青年珠江学者。2014年博士毕业于美国弗吉尼亚大学生物系(University of Virginia)。2014-2018年在国际药企葛兰素史克(GlaxoSmithKline)任博士后与高级研究员，2018年作为青年拔尖人才引进加入华南师范大学。从事人体微生物组学相关研究，重点应用多组学技术及疾病动物模型探究慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)等呼吸系统疾病中肠道、气道菌群功能及菌群—宿主互作机制。以第一或通讯作者在American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine（IF：21.41），European Respiratory Journal（IF：16.68），Thorax（IF：9.14），ISME Journal（IF：10.30）等期刊发表SCI论文30余篇，H-index为18。受到期刊Editorial评述与Faculty Opinion(原F1000Prime)推荐。撰写Nature-Springer出版的Methods Molecular Biology系列专著《Bacterial Pangenomics》第九章节微生物宏基因组分析方法学（ISBN：978-1-0716-1098-5）。主持国家自然科学基金面上项目、广东省“青年珠江学者”等科研与人才项目多项。担任广东省精准医学应用协会微生态医学分会常务委员、广东省慢阻肺康复工程技术研究中心委员等职务。担任Medicine in Microecology期刊Editorial Board Member，mSystems等期刊审稿人。课题组拟招收生物信息学或分子生物学相关博士后与博士生多名，待遇优厚，有意向者欢迎联系：[e-mail]

Reference

Yongliang Chu,Silong Sun,Yufen Huang,Qiang Gao,Xuefeng Xie,Peng Wang,Junxia Li, Lifeng Liang, Xiaohong He, Yiqi Jiang, Maojie Wang, Jianhua Yang, Xiumin Chen, Chu Zhou, Yue Zhao,Fen Ding,Yi Zhang,Xiaodong Wu,Xueyuan Bai, Jiaqi Wu,Xia Wei,Xianghong Chen,Zhen Yue,Xiaodong Fang,Qingchun Huang,Zhang Wang,Runyue Huan. Metagenomic analysis revealed the potential role of gut microbiome in gout. npj Biofilms Microbiomes 7, 66 (2021). https://doi.org/10.1038/s41522-021-00235-2