【基础】流式胞内细胞因子检测 II / 开普饭

B.胞内细胞因子和细胞表面抗原的多色染色方案

一，收获细胞

可以从体内刺激的组织或体外培养物刺激制备活的活化细胞群。可以将细胞悬浮并分配到塑料管或微孔板中用于免疫荧光染色。在染色和储存过程中应保护细胞免受光照。

二，阻断Fc受体

阻断Fc受体的试剂可用于减少非特异性免疫荧光染色。

小鼠Fc受体阻断：针对FcgII/III受体的纯化的2.4G2抗体(Fc Block™)可用于阻断由Fc受体介导的荧光抗体的非特异性染色。为了用小鼠Fc Block阻断小鼠Fc受体，将预孵育的细胞悬浮液与1μg Fc Block/10e6个细胞在100μl染色缓冲液中，4℃孵育15分钟。然后再用特异性荧光抗体染色细胞。
人Fc受体阻断：可以通过将细胞与来自相同物种的过量无关纯化的Ig，或使用和免疫荧光染色的抗体相同亚型的纯化抗体共孵育，或通过与PBS中的10％FCS预孵育来阻断Fc受体。
大鼠Fc受体阻断：针对FcgII受体的D34-485纯化抗体(Rat Fc Block™）可用于阻断由受体介导的荧光抗体的非特异性染色。将细胞悬浮液与1μg Fc Block™/10e6个细胞在100μl染色缓冲液中，4℃孵育15分钟，以阻断大鼠Fc受体。然后再用特异性荧光抗体染色细胞。

三，染色细胞表面抗原

预先滴定的最佳浓度（≤0.5μg）的细胞表面抗原特异性单克隆荧光抗体，和~10e6个细胞在50μl染色缓冲液（100μl用于管中染色）中，4℃共孵育15-30分钟。例如， CD3，CD4，CD8，CD14或CD19。改变程序以使细胞在细胞表面抗原染色之前被固定需要根据经验鉴定合适的抗体克隆。

注意：一些识别细胞表面天然标志物的抗体可能不会与固定/变性后抗原结合。出于这个原因，建议在固定/透化和胞内细胞因子染色之前，用活的、未固定的细胞进行细胞表面抗原的染色。
用染色缓冲液洗涤细胞2次（1ml /洗涤，管中染色），离心沉淀（250×g），并除去上清液。

四，固定和透化细胞

重悬细胞于100μl（250μl，管中染色）Cytofix/Cytoperm™溶液中，4℃ 10-20分钟。

注意：在添加Cytofix/Cytoperm™溶液之前，可以通过涡旋来避免细胞聚集，使细胞混匀彻底。
在1X Perm/Wash™溶液中洗涤细胞两次（1ml /洗涤，管中染色），沉淀并除去上清液。

注意：在洗涤步骤中需要Perm/Wash™溶液以使细胞保持透化状态。

四‘，替代固定和透化方法

可以固定和储存细胞以在稍后的时间继续细胞内染色。

·细胞的固定和储存

·透化固定的细胞

五，细胞内细胞因子染色

在50 µl Perm/Wash™溶液（100μl用于管中染色）中彻底重悬固定/透化细胞，溶液中预加有最佳浓度的荧光标记细胞因子抗体或适当的阴性对照。4°C避光孵育30分钟。
用1X Perm/Wash™溶液洗涤细胞2次（1ml /洗涤以在管中染色）并在流式细胞术分析之前重悬于染色缓冲液中。
对于大多数细胞因子，细胞可以留在染色缓冲液中，第二天进行分析。在分析之前延长放置时间可能会导致荧光信号的减弱。

C.全血样本活化和细胞内染色技术方案

用RPMI1640培养基稀释全血1：1体积（例如100μl：100μl）并充分混合。
在蛋白质转运抑制剂如含brefeldin A的GolgiPlug™或含monensin的 GolgiStop™存在下，将细胞活化剂或促分裂原加入稀释的血液中，例如50 ng/ml PMA + 1 µg/ml calcium ionophore A23187或 PMA + 1 µM ionomycin (终浓度)。
短暂涡旋混合。将200μl等分至12×75mm塑料管中。在37℃下在5％CO2中孵育4-6小时。
加入2ml 红细胞裂解液，涡旋，在室温下避光孵育10分钟。
离心5分钟，500×g。
吸出上清液。在染色缓冲液中洗1次。以500×g离心5分钟。吸出上清液。
继续执行上述一般方法B部分的步骤3-5。

D.流式细胞分析

使用细胞表面染色对照管设置PMT电压和补偿。根据阻断对照，同型对照或未染色细胞设置阴阳性界限标记。

存在于活化的人PBMC培养物中的细胞因子产生细胞的频率可以由于供体变异性而广泛变化。因此，来自单个供体的冷冻保存的细胞可用于纵向研究。

为了进行适当的流式细胞分析，应通过光学显微镜和/或流式散射光图检查通过该方法染色的细胞，以确认它们分散良好。为了进行统计学上准确的各群体分析，应收集足够多Events的细胞信息。可以在数据再分析时生成双变量点图或等高线图，以显示各个细胞共表达某些水平的细胞表面抗原和细胞内细胞因子蛋白的频率和模式。

E.染色对照

1.阳性染色对照

抗细胞因子荧光抗体的TDS描述了体外阳性培养系统，可在特定时间点诱导可检测频率的细胞因子产生细胞。通过这些方法刺激的细胞可用作实验系统的阳性对照。已发表的免疫荧光染色报告和ELISPOT分析也可提供有关产生细胞因子产生细胞的不同实验方案的有用信息。

PharMingen提供的细胞内细胞因子阳性对照细胞，一组活化和固定的白细胞群，已经过细胞因子产生的筛选。

2.阴性对照

以下三种对照之一可用于区分特异性染色与人为染色。研究人员应选择哪种对照最符合他们的研究需求。

·同型对照：和特异性抗体相匹配的同亚型对照染色。

将细胞沉淀重悬于50 µl Perm/Wash™溶液（100μl用于管中染色），其含有抗细胞因子抗体相同浓度的同型对照抗体(< 0.5 µg/10e6 细胞)。
4°C孵育15-30分钟。
使用上述用于细胞内染色的程序洗涤细胞。

·配体阻断对照：用重组细胞因子预阻断抗细胞因子抗体。

·抗体阻断对照：用没有标记荧光染料的抗体预孵育细胞。

将固定/透化细胞重悬于25μlPerm/ Wash™溶液（50μl用于管中染色），其中含有未缀合的抗细胞因子抗体（与缀合抗体相同的克隆）稀释至适当浓度（>5μg/ 10e6细胞），在4°C下孵育30分钟。
孵育后，在25 µl Perm/Wash™缓冲液（50μl用于管中染色）中加入荧光抗细胞因子抗体，最终体积为50μl用于微孔板或100μl管中，4°C孵育30分钟，染色。
使用上述用于细胞内染色的程序洗涤细胞。

染色缓冲液

THE

END

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