6+分的单细胞结合湿实验值得学习！
Comparative Molecular Analysis of Cancer Behavior Cultured In Vitro, In Vivo, and Ex Vivo体内培养（In Vivo）和体外培养（In Vitro,Ex Vivo）的癌症特征的分子比较分析
一、 研究背景
在动物模型中表现出优异性能的新疗法超过95％因为治疗无效或毒性而无法应用于临床。不同肿瘤模型中的EMT异质性和基质异质性对于了解现有培养模型的缺陷，模拟体内肿瘤和指导对治疗的反应至关重要。然而，现在主要通过bulk RNA-seq或微阵列分析获得临床肿瘤样本的基因表达数据，无法反映肿瘤微环境中的细胞异质性。而且现在许多模型并不能很好地模拟患者体内肿瘤进展，例如：In Vitro实验中的3D培养，虽然与2D培养相比可以模拟细胞与细胞间复杂的相互作用以及细胞外基质 （ECM）成分，但它的细胞只能从表面获取营养物质和药物，不能模拟复杂的异质细胞组成以及体内发生的营养物质或药物的扩散；患者异种移植肿瘤模型（PDXs）虽然考虑了体内肿瘤的发展并纳入了相关微环境的组成部分，但是动物体内缺乏完整免疫系统，这些模型对于评估许多免疫疗法效用不大。
原发性临床肿瘤的异种离体类器官培养（类瘤tumoroids），由于易于培养以及能维持基质细胞复杂性，受到广泛关注，但是其基质细胞亚群组成以及其对癌细胞行为的影响尚待深入研究。
二、 分析流程
三、 结果解读
1.癌细胞的转录组受培养条件的影响
4T1细胞可以在同源具有免疫能力的BALB/c小鼠中形成肿瘤，经过一系列的培养得到三维球状聚集体，这种肿瘤球状体由一个癌症干细胞/祖细胞的增殖聚集形成，可以在无血清，非粘附条件下存活。体外实验包括2D培养的4T1单层细胞（图1.C），在非粘附孔板培养基中培养的3D球状体（图1.D）以及在明胶纤维蛋白水凝胶中培养的球状体（图1.E）。体内实验使用了ptagBFP-C质粒，将4T1细胞转染后，经过后续选择得到稳定转染的细胞，再进行FACS分选获得了高BFP（蓝色荧光蛋白）表达的细胞，最后将4T1-BFP细胞接种到免疫缺陷（NSG）小鼠的原发性肿瘤和同源的具有免疫能力的（BALB/c）小鼠中，接种方式有两种，一种注射到乳腺脂肪垫（MFP），另一种注射到皮下（SQ）。形成肿瘤后将肿瘤切除，分离并扩增。作者对以上不同培养方式生长的4T1细胞进行RNA测序，以确定培养环境驱动的分子表型。
3DM：培养基中的3D球状体培养；3DG：水凝胶中的3D球状体培养；TBS：皮下注射；TBM：乳腺脂肪垫注射；SBS：分选后的皮下注射；SBM：分选后的乳腺脂肪垫注射；SNS：免疫缺陷鼠分选后的皮下注射；SNM：免疫缺陷鼠分选后的乳腺脂肪垫注射。
因为BALB/c小鼠中SBM模型是从原位纯化的，并且肿瘤细胞在具有健全免疫能力的小鼠体内生长，对于模拟临床的癌细胞行为最具有代表性。从图1.C-G可以看出体内的4T1-BFP +肿瘤细胞比球状体更密集，图1.G可以看到标记的4T1细胞被其他基质细胞包围。（蓝色为DAPI核染色；红色为鬼笔环肽染色的肌动蛋白丝；绿色为BFP的表达）
图1.实验概述
传统的癌细胞培养通常采用2D培养，所以作者以2D培养的转录谱作为参考，鉴定了每种培养方法中的差异表达基因（DEG）。测序数据已使用FastQC软件（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行了质量检查。作者使用STAR比对软件将reads映射到小鼠基因组（mm10），使用Rsubread包中的“ featureCounts”确定每个基因的读取计数，仅选择了在至少3个样品中reads≥10的基因进行分析。随后，作者使用EDASeq包进行样本间归一化，RUVseq包处理了批次效应，edgeR包基于FDR p-value<0.05和fold change>2鉴定了DEG。
4T1的MFP培养（图1.F，TBM）和SQ培养（TBS）转录谱与2D培养的转录谱差异最大（图2.A），这可能是由于MFP、SQ培养中基质细胞差异引起的。而TBM和TBS之间显示出高度相似性（图2.BC）。但是，TBM/TBS与2D培养的差异基因与4T1细胞的变化无关，因为未分选的和分选出来的4T1-BFP +仅有1251个（48％）上调的基因和336个（24％）下调的基因重叠（图2.E）。
SBM是模拟体内肿瘤发展的最优模型，而图2.BC可以看到相比于2D培养，3D球状体诱导了更高水平的体内样转录水平。MFP和SQ模型的4T1-BFP +细胞转录谱在具有免疫能力（SBM/SBS）和免疫缺陷（SNM/SNS）小鼠中均高度相似，SBM与SBS有79％重叠的DEG，SNM与SNS有83％重叠的DEG。此外，正如作者预期，免疫缺陷的确驱动了4T1细胞基因表达的改变，在SNM和SBM中仅有75％上调基因（1993/2604）和73％下调基因（1017/1385）重叠（图2.D）。
图2.在不同培养条件下癌细胞的转录组变异性
作者进一步使用ToppGene（https://toppgene.cchmc.org/）进行GO和途径富集分析，发现同系小鼠中的4T1-BFP +细胞中与分化以及与肿瘤微环境相互作用的基因有富集（表1.上）。此外，ECM，免疫应答，细胞信号传导以及细胞的极化和迁移均有富集。相对于体内培养的癌细胞，单层培养的细胞在细胞增殖方面的细胞过程中富集（表1.下），例如DNA合成，RNA加工，蛋白质翻译以及细胞周期进程。
表1.与从原位和同源4T1小鼠肿瘤中分离出来的2D与癌细胞中高表达基因相关的本体
2.培养条件可以影响对癌症进展至关重要的癌细胞行为
细胞周期的失调是癌症起始的标志，也是众多化学治疗方法的靶标。然而对于癌症进展来说还需要有细胞代谢的改变，包括细胞外基质重塑，细胞间通讯，以及上皮间质状态的转变。所以接下来作者进一步评估了这些与肿瘤进展相关的生物过程的差异表达，以了解不同培养条件对癌细胞行为的影响。
与增殖和细胞分裂相关的基因在2D中高表达，但在体内肿瘤的4T1细胞中这些基因表达最少（SBM中有88个细胞周期相关基因下调，图3.A）。但在体内培养中也有22种与细胞周期相关的基因，例如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1a（Cdkn1a），细胞周期的调节剂和泛素蛋白酶体系统成员（Ubb，Ubc，Psmb8，Psmb9，Psmb10，Psme1，Psme2）的表达水平较高，与人类增殖性胚胎干细胞（hESC）相关的免疫蛋白酶（Psmb8-10）改变提示体内模型干性相关基因的上调。图3.B也显示相比3DG、3DM与2D，体内肿瘤模型分选细胞的细胞周期基因受到了显著的抑制。
细胞周期过程不仅在转录水平受到调控，而且包括严格的翻译和翻译后调控，所以作者进一步比较了磷酸化Cdk1（有丝分裂进程的调节因子）和磷酸化Mcm2（S期的调节因子）表达。在单层培养中观察到p-Cdk1和p-Mcm2的上调，在3D培养中观察到它们的下调，在体内培养的细胞中观察到最低的表达（图3.CD）。
图3.单层培养中培养的细胞中，细胞周期进展基因上调
肿瘤ECM的结构和重塑能够影响肿瘤进展，单层生长的4T1细胞的核心基质基因（图4.A），与ECM调节相关的基因（图4.B）和细胞基质粘附基因（图4.E）表达均较低。对于多数ECM基因，相比SBM中最高的上调水平，免疫缺陷模型（SNM）中上调的程度较低，而在3D培养条件下，表达进一步降低（图4.D）。相比于3DM，水凝胶中培养的球状体（3DG）核心基质基因（图4.C）和ECM调节基因表达水平更高，因此与体内模型的癌细胞行为更为相似。
接下来作者通过流式细胞仪验证了两个ECM调节剂（基质金属蛋白酶ITGAM和ITGA4）的蛋白质表达，ITGAM蛋白表达随培养复杂性增加而增加，其中2D培养的细胞表达最低，SBM表达最高（图4.FH），在转录数据中也是一致的（图4.G）。但3DM样品无法检测到蛋白质。
图4.3D和体内条件下培养的细胞中，细胞外基质相关基因被上调
癌细胞的许多行为变化，包括增殖，运动和免疫相互作用，都可以在细胞信号通路的激活中体现出来。作者通过无监督聚类确定了几种细胞信号通路（RAS，TNF，PI3K-AKT，MAPK，干扰素和白介素）在体内条件下显著上调，在3D培养下显示出中等程度的上调。其中IFNα/β（图5.AC）、IFNγ（图5.BD）和白介素的信号传导（图5.E）在从具有免疫能力的小鼠（SBM）分离的癌细胞中显著上调，在免疫缺陷小鼠（SNM）中上调程度显著降低。
尽管作者没有发现SBS和SBM条件下IFNγ受体的上调，但相对于2D培养，β-微球蛋白（B2M）（IFNγ信号的下游靶标）在BALB / c肿瘤中上调了9.03倍（图5.I），表明癌细胞中IFNγ途径显著上调。通过流式细胞仪分析的蛋白质水平定量证实，完整的免疫系统能促进B2M表达，而在NSG小鼠或3D条件下的激活极少（图5.JK）。STAT复合物作为关键转录因子，磷酸化STAT参与了IFNα/β和IFNγ信号激活，与转录水平（图5.F）一致，仅在BALB/c的癌细胞中观察到pStat1水平显著增加（图5.GH）。这些结果说明了基质细胞和免疫细胞参与体内癌症细胞信号转导的重要性。
图5.在同源培养条件下，细胞信号高度上调
通过细胞周期进程抑制增殖，增加ECM重塑，刺激细胞信号通路，是上皮-间质(EMT)转变的标志。最近有研究根据EMT进程划分了不同的肿瘤细胞亚群，包括：early hybrid, hybrid, late hybrid和mesenchymal states。为确定各种培养条件诱导的细胞EMT状态，作者首先评估了与EMT相关的基因表达水平（图6.A），4T1单层细胞表达高水平的上皮标志物Cdh1和Esrp，低水平的间质标志物Mmp19和Vim；而在体内条件下，EMT标记Krt14以及早期hybrid标记Trp63和Grhl2显著上调；晚期hybrid标志Smad3和间充质标记Mmp19在3D和体内条件下均显著上调，这表明体内肿瘤处于多样化的EMT混合状态。混合EMT表型可能与增加的肿瘤干性有关，而完全上皮或完全间质的表型可能与干细胞标志物的丧失和致瘤性有关。
作者接下来使用流式细胞仪分析进一步探究2D和3D培养诱导的EMT状态的异质性，上皮表型的丧失可以用Epcam缺失来衡量。图6.B显示了流式细胞术中Epcam缺失的细胞比例，与转录数据（图6.A）一致，单层细胞在很大程度上维持了上皮状态，只有3.6％的细胞经历EMT，而3D培养和体内培养经历EMT的频率增加。
此外，作者还根据细胞表面标记CD51，CD61和CD106表达，进一步分析了EMT细胞的hybrid状态。体外培养比体内培养有更多的间充质细胞丰度，而体内培养的细胞具有丰富的early hybrid亚群。而免疫缺陷肿瘤中early hybrid EMT细胞丰度的增加和late hybrid EMT细胞丰度的降低表明，EMT受到了免疫系统调节。（图6.C）
（1）early hybrid（三阴性或CD106+）（2）hybrid（CD51+或CD51+/CD106+）（3）late hybrid（CD51+/CD61+ ）（4）间质状态（CD51+/CD61+/CD106+）
图6.体内的4T1细胞处于多种上皮-间充质过渡（EMT）状态
3.含有基质细胞的体外类肿瘤模型保留了体内模型的肿瘤特征
以上细胞信号传导过程和EMT状态的RNA和蛋白质水平差异分析揭示，基质复杂性会影响癌细胞的行为。但是，经典体外模型并不包含基质细胞。为了评估体外模型中基质细胞的作用，作者从癌细胞的匀浆中以单层或球体体形式培养了5天，然后进行了FACS筛选，以进行转录组分析（图7.A）。基质成分的掺入增加了4T1总体转录组与SBM的相似性，离体单层（EV2D）和球状体（EV3D）比其他4T1体外方法与SBM更相似（图7.B）。
对细胞周期、ECM和细胞信号转导相关的基因分析进一步验证了图7.B的转录组分析结果，与EV2D或体外培养相比，EV3D在细胞周期、ECM和细胞信号转导方面更好地保留体内特征（图7.C-E）。离体培养5天后进行EMT的4T1细胞的流式细胞仪分析（图7.F）表明类瘤模型中基质细胞的存在维持了较高的癌细胞EMT多样性。然而，离体类瘤培养能促使EMT细胞更快进入间充质状态（EV3D：49％，EV2D：35％），并减少了处于过渡性EMT状态的细胞频率（图7.G）。
图7. 离体类肿瘤培养物促进了类体内癌细胞的行为
尽管含有基质细胞的体外类瘤模型保留了体内模型的肿瘤特征，但仍与体外模型表现出一定的相似性，作者假设这是类瘤模型丧失了部分的细胞亚群引起的。为了研究体内肿瘤和类瘤成分的差异，作者使用了scRNA-seq比较3D类瘤中的细胞异质性。作者使用了10×Genomics进行单细胞测序，Cell Ranger（由10×Genomics公司提供，专门用于分析10X 单细胞转录组数据的pipeline）和Seurat包对原始数据拆分demultiplexing，质量控制和分析。
作者先用Cell Ranger单细胞软件处理了barcode和对单细胞的基因3'端计数，先将样本demultiplexing，然后与小鼠基因组（mm10）进行比对，再使用cellranger count根据UMI（唯一分子标识符）进行计数。
然后在R中使用Seurat包进行进一步分析，分析中不包括每个细胞中检测到的基因少于500个的细胞以及少于5个细胞表达的基因。对表达数据进行了对数归一化后，在每个数据集中确定了2000个变化最大的基因，然后标准化为平均值为0和方差为1的表达矩阵，并通过主成分分析（PCA）（30个主要成分）降维，然后将前20个主要成分进行UMAP非线性降维，并基于图形聚类。使用了“ FindNeighbors”函数基于PCA中的欧式距离构建了k-最近邻算法（KNN），为了更好地聚类细胞，作者接下来应用模块化优化技术Louvain算法通过“ FindClusters”函数将细胞迭代地分组。在集成数据集中总共识别出14个聚类。
在离体培养的5天中，类瘤中肿瘤细胞的比例增加了一倍以上（图8.A）。然后作者比较了肿瘤和类瘤中增殖性癌细胞（Epcam+/Mki67+）的丰度（图8.C）、炎性巨噬细胞（Ptprc +/CD14+/Il1b+）的丰度（图8.D）、肌成纤维细胞的丰度（Thy1+/DCN+/Acta2）（图8.E），发现体内的肿瘤具有更高的免疫细胞浸润，在离体培养过程中炎性巨噬细胞，中性粒细胞和B细胞丰度下降，而抗炎和增殖的骨髓细胞在类瘤中丰度上升。T细胞/NK 细胞、内皮细胞的比例保持不变。这些结果提示类瘤迅速转变为间充质状态的潜在原因可能是通常抑制上皮向间充质转化的基质细胞类型的耗竭，尤其是炎性巨噬细胞的减少。
图8.4T1肿瘤和类瘤培养物的单细胞RNA-seq分析
小结
本篇研究中4T1小鼠乳腺癌细胞的2D和3D培养模型、免疫能力健全和NSG小鼠皮下或原位同种异体移植物以及离体类瘤的转录组谱分析揭示了它们的表达谱改变以及差异生物过程。与2D培养相比，3D培养具有更多的体内转录特征。体内肿瘤中有更多的细胞经历EMT，细胞异质性程度更高，而体外培养中的细胞主要以上皮或间充质状态存在。离体类瘤融合了体内和体外培养的特征，但scRNA-seq表明，离体类瘤虽然迅速扩大了癌症和成纤维细胞的数量，但却损失了大量的免疫成分。而NSG和BALB / c小鼠模型的比较进一步确定了一个健全的免疫系统对肿瘤进展的影响，这对于评估PDX小鼠中表征人类肿瘤的局限性至关重要。这项研究强调了需要继续改善各种培养条件，以保留基质成分和EMT多样性来获得更好的可以应用于临床前的药物筛选模型。