补肾活血中药治疗薄型子宫内膜不孕症的临床及机制研究
目的1.通过对补肾活血中药治疗薄型子宫内膜不孕症患者的临床疗效观察,从而为薄型子宫内膜提供有效的治疗方法。2.通过体外实验观察子宫内膜干细胞(EDSCs)给予补肾活血中药作用后,细胞增殖力、凋亡率的变化;Wnt/β-catenin信号通路在薄型子宫内膜中的调控作用以及阻断Wnt/β-catenin信号通路后,补肾活血中药对EDSCs标志物的影响,进一步分析补肾活血中药治疗薄型子宫内膜的作用机制。3.通过体内实验建立大鼠肾虚血瘀薄型子宫内膜模型后观察补肾活血中药对大鼠子宫内膜容受性、Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin蛋白以及对子宫内膜干细胞标志物的影响,为补肾活血中药的临床应用提供科学依据。
方法1.选取于北京妇产医院中医科就诊的70例薄型子宫内膜不孕症患者,随机数字表法分为治疗组(补肾活血中药+补佳乐)和对照组(补佳乐)。对照组:于月经周期第5天开始服用补佳乐,每天1次,每次2mg,连续服用21天。治疗组:在对照组治疗措施基础上同时加用补肾活血中药,连续服用21天。治疗3个月经周期。分别观察两组治疗前后月经量情况、中医证候积分、子宫内膜厚度、子宫内膜类型、子宫动脉搏动指数、子宫动脉阻力指数以及临床妊娠情况等。2.选取于北京妇产医院中医科就诊的薄型子宫内膜患者,取子宫内膜后分离、培养EDSCs,在给予补肾活血中药药物血清干预后,MTT法检测EDSCs增殖力,流式细胞仪法检测EDSCs凋亡率、免疫组化法检测Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin在EDSCs中的表达以及TCF的显性负性突变体(dnTCF)表达质粒转染EDSCs阻断Wnt/β-catenin信号的转导,免疫荧光法检测CD34/CD117、q-PCR法检测Oct-4基因、Westernblot法检测ABCG2蛋白的变化。
3.建立大鼠肾虚血瘀薄型子宫内膜模型,补肾活血中药作用后,HE染色观察对大鼠子宫内膜厚度、子宫内膜间质厚度、子宫内膜腺体数、子宫内膜血管数以及上皮细胞及间质细胞的影响;免疫组化法检测补肾活血中药对Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin蛋白表达的影响以及q-PCR法、Westernblot法检测对子宫内膜干细胞标志物Oct-4、ABCG2蛋白表达的影响。
结果1.比较治疗组和对照组年龄、文化程度、清宫次数等一般资料,两组无显著性差异(P>0.05);月经量改变情况:治疗组及对照组治疗前后有显著性差异(P<0.01),组间治疗后比较,治疗组对月经失血图评分改善明显优于对照组(P<0.05);中医证候积分:治疗组及对照组治疗前后有显著性差异(P<0.05),组间治疗后比较,治疗组对中医证候积分的改善明显优于对照组(P<0.05);子宫内膜厚度改善情况:治疗组及对照组治疗前后相比较差异有显著性(P<0.05),组间治疗后比较,治疗组对子宫内膜厚度的改善明显优于对照组(P<0.05);A型子宫内膜比例:治疗组与对照组治疗前后有显著差异(P<0.05),组间治疗后比较,治疗组A型子宫内膜比例的改善明显优于对照组(P<0.05);子宫动脉搏动指数PI及子宫动脉阻力指数RI:治疗组与对照组治疗前后均有显著差异(P<0.05);组间治疗后比较,治疗组PI、RI降低程度明显高于对照组(P<0.05);临床妊娠情况:治疗3个月经周期后,治疗组临床妊娠率高于对照组(P<0.05)。2.体外实验:EDSCs增殖:结果显示各给药组与对照组之间有极显著性差异(P<0.01),倒置显微镜和荧光显微镜下观察细胞增殖情况均显示补肾活血中药药物血清能增加EDSCs的增殖;EDSCs凋亡:透射电镜及流式细胞仪法显示补肾活血中药药物血清能降低EDSCs的凋亡;EDSCs中β-catenin的表达:高剂量与补佳乐组较对照组有极显著性差异(P<0.01);EDSCs中β-catenin/TCF转录活性:转染不同质粒,同组转染OF与转染OT之间均存在显著性差异(P<0.05);转染OT,中、高剂量组和补佳乐组与对照组均有显著性差异(P<0.05);EDSCs中CD34/CD117蛋白表达:CD34蛋白:中剂量较对照组有显著性差异(P<0.05),高剂量与补佳乐组较对照组有极显著性差异(P<0.01);CD117蛋白:中剂量、高剂量较对照组有显著性差异(P<0.05),补佳乐组较对照组有极显著性差异(P<0.01);EDSCs中Oct4基因表达:给药组与对照组存在显著性差异(P<0.05);EDSCs中ABCG2蛋白表达:给药组与对照组存在显著性差异(P<0.05);阻断Wnt/β-catenin信号通路后CD34/CD117、Oct4、ABCG2均有不同程度的下降,且有显著性差异(P<0.05)。3.体内实验:子宫内膜厚度:模型组大鼠子宫内膜厚度低于对照组,有极显著性差异(P<0.001);低剂量组、中剂量组、高剂量组、补佳乐组大鼠子宫内膜厚度高于模型组,有显著性差异(P<0.05);子宫间质厚度:模型组大鼠子宫间质厚度低于对照组,有极显著性差异(P<0.001);低剂量组、中剂量组、高剂量组、补佳乐组大鼠子宫间质厚度高于模型组,有极显著性差异(P<0.001);子宫腺体数:模型组大鼠子宫腺体数少于对照组,有显著性差异(P<0.001);中剂量、高剂量、补佳乐组大鼠子宫腺体数多于模型组,有极显著性差异(P<0.001);子宫血管数:模型组大鼠子宫血管数少于对照组,有极显著性差异(P<0.001);中剂量、高剂量、补佳乐组大鼠子宫血管数多于模型组,有显著性差异(P<0.05);子宫内膜上皮细胞面积:模型组大鼠子宫内膜上皮细胞面积小于对照组,有极显著性差异(P<0.001);中剂量、高剂量、补佳乐组大鼠子宫内膜上皮细胞面积大于模型组,有显著性差异(P<0.05);子宫内膜间质细胞面积:模型组大鼠子宫内膜间质细胞面积小于对照组,有极显著性差异(P<0.001);低剂量组、中剂量组、高剂量组、补佳乐组大于模型组,有极显著性差异(P<0.001);β-catenin蛋白:模型组较对照组极显著降低(P<0.001);给药后各组β-catenin不同程度增加;低剂量组较模型组有显著性差异(P<0.05);中剂量、高剂量、补佳乐组与模型组有极显著性差异(P<0.001);Oct4基因:模型组较对照组极显著降低(P<0.001);给药后各组Oct4表达量不同程度增加;其中低剂量,中剂量与模型组无显著性差异;高剂量与模型组有极显著性差异(P<0.001);补佳乐组与模型组有显著性差异(P<0.05);ABCG2蛋白:模型组较对照组极显著降低(P<0.001);给药后各组ABCG2表达量不同程度增加;其中低剂量与模型组无显著性差异;中剂量组与模型组有显著性差异(P<0.05);高剂量、补佳乐组与模型组有极显著性差异(P<0.001)。结论1.补肾活血中药治疗能够增加薄型子宫内膜不孕症患者的月经量,改善肾虚血瘀证的症状,提高子宫内膜的厚度,增加A型子宫内膜的比例,降低子宫动脉搏动及阻力指数,提高临床妊娠率。
2.补肾活血中药药物血清可以增加EDSCs的增殖,减少凋亡,能够促进EDSCs内β-catenin/TCF介导的核转录,增加EDSCs标志物CD34/CD117、Oct4、ABCG2的表达,阻断Wnt/β-catenin信号通路后CD34/CD117、Oct4、ABCG2的表达均有不同程度的下降。
3.补肾活血中药可以增加肾虚血瘀薄型子宫内膜模型大鼠子宫内膜厚度、子宫内膜间质厚度、子宫内膜腺体数、子宫内膜血管数、子宫内膜上皮细胞及间质细胞面积、β-catenin蛋白、Oct4基因及ABCG2蛋白的表达。...