陈家锃：过度检测，适得其反——检测在非洲猪瘟防控中的科学应用
常见问题一：
平时风平浪静，样品量少，实验室检测结果相对准确。一有风吹草动，生产体系即开始全群采样排查。检测人员加班加点对样本进行检测，一段时间内有可能出现多份样本可疑。对可疑样本换试剂盒复检，样品结果可能又呈阴性。
主要原因有：
（1）没有根据统计学规律、猪群分布特点和疾病传播特点制定采样方案，导致样本量过大，检测量超出了实验室的承载能力；
（2）实验室中缺少清除气溶胶的环境控制设施，阳性对照或阳性样本由于PCR管材密封不严或操作中的交叉污染，逸出气溶胶导致污染后续样本，尤其是在针对超出承载能力的样本量时，更易产生失误。
常见问题二：
生产体系以周为节律，对猪群进行筛检，以求在非洲猪瘟潜伏期内第一时间发现病原。由此产生大量样品，采样和检测人员多班倒。猪场一旦真正发病，往往多点发病。
主要原因有：
没有根据风险级别制定对应的采样方案，“体检”的频率过高，采样工作强度大，在采样过程中生物安全工作容易执行不到位，一旦真出现感染源，采样过程可能也是散毒过程。
（1）明确责任主体，负责检测方案的制定和与检测中心的协调
检测工作应由了解猪场猪舍实际情况的兽医（生产管理型兽医）发起，并由检测中心负责人根据样品检出情况与驻场兽医共同制定下一阶段的采样方案。明确责任主体让专业的人负责制定检测方案，不但可以保证检测结果更加可靠，也能通过样本的科学分布确定最小的排查范围，这是节省人力、物力，发挥检测最大效能的前提。
（2）监测有侧重点，制定不同场景下的监测与检测预案
监测和检测的频率与风险等级密切相关，需根据风险等级建立检测联动机制。
1）在风险等级较低时，日常监测的重点应是车辆、人员、物资等来自外部的威胁。可定期对猪场周边的环境进行定期的排查，如在春节期间，针对周边有杀“年猪”的情况出现时，需要对环境进行采样检测，对进出猪场的车辆、物资和人员自然也要加大检测的强度。当周边出现死猪时，需要对地表水进行检测；
2）当周边环境中人流、物流、车流中检出频次增加时，表明猪场面临的风险在增强。除增加消毒频次外，此时可加大对猪场内环境的检测。可对人员、粉尘、水源、道路、污水池、工具、衣物等区域增加检测频次，以督促生物安全制度的落实，通过检测也能掌握猪场的风险点，并能及早制定对风险点的预案；
3）全群性排查工作不宜过频，应以异常猪的日常监测为主。猪越来越金贵，猪场希望通过逐头检测尽可能减少冤杀猪的想法无可厚非。但有些猪场以7天为节律进行猪群排查，采样多，随之而来会造成检测任务重，检测过程中难免出现交叉污染等问题。
对于猪群普查的启动要以猪场的风险等级，猪群健康状况为参考依据，如当在外围出现多起车辆或人员检出阳性时或进出人员频次较大时，兽医团队可以针对猪群进行排查，辅助以猪栏、料槽等环境样本以便排查地更为彻底。随着非瘟潜伏期的延长，除了核酸检测外还可以结合抗体监测进行普查，抗体监测可每年监测2～3次；
4）对猪群尤其针对异常猪的日常监测，要常抓不懈。规模化猪场往往从妊娠母猪开始发病，针对妊娠母猪，只要发现剩料的，就要立即进行唾液或鼻拭子采样检测。针对育肥猪中的异常猪，出现精神状态不佳、拱料不食、喜卧的猪可通过唾液、鼻腔液或直肠拭子进行采样确诊。
（3）启动定点清除前先确定感染范围，可减少样本量
大多数猪场进行定点清除时，往往先对猪逐头检测后再对感染猪进行清除，这种操作方法在时间上滞后，人员操作存在交叉传播的风险。可先根据猪场猪舍分布，以单元格模式在各区域对异常猪和环境进行采样，先确定风险的区域后在此区域内再筛查，定点清除效率会更高。建议采取以下步骤进行操作：
1）发现阳性猪后，先按预定的清除路线将发病猪移出猪舍。剔除过程中可对剔除的每头猪进行采样，检测感染比例和病毒载量（此数据可作为对周边猪群处理或监测的依据）；
2）对送检不便的猪场，确诊后可以依据临床症状对易感猪和疑似猪进行淘汰（而不是等待检测结果出来再淘汰，以免延误战机）。在对减料不食的猪剔除过程中仍需对其进行采样，此数据可作为后续淘汰力度的依据；
3）以检出的阳性的猪栏为圆心，对周边栏的通道和栏杆进行环境检测，对区域内的异常猪只进行采样检测，从而确定有几栋猪舍发病和可能感染的危险区。对人员交叉情况进行分析，确定需监控的区域。在监控区内开展两个潜伏期的监测与排查，以相对静默的方式进行排查，减少猪群的应激；
4）在对风险区内猪只进行剔除时，按时间轴线绘制不同时间点的病毒载量和检出率的变化趋势，以便评价疫情控制的效果，从而及时调整消毒和管理方案；
5）猪群在两个潜伏期内未出现新的阳性个体后，仍需持续对环境样本（尤其是污水池等区域）监测一个月，以监督生物安全措施的落实，彻底清除猪场内的病原。
（1）采样流程培训和相关装备的配备是结果可靠的前提
除需对一线操作人员进行采样流程SOP培训之外，还需配备必要的采样工具、消毒和防护措施，从而降低交叉污染的概率。对于样本的保存可配置相关工具，例如唾液样本容易被降解，可配备冰盒、样品保存液、运输时配备专用的保温箱，都是保证结果可靠性的前提。采样过程中最好设置双人，专人记录、互相监督，保证采样的正确和信息的准确；
（2）以可靠样本进行确诊是启动定点清除的核心
确诊仍是第一要务，在此笔者并不是否认唾液或鼻拭子在提前发现传染源中的价值，但仅仅根据唾液或鼻拭子核酸呈弱阳性就启动定点清除或呈阴性就排除感染风险，笔者认为都是有待商榷的。因为无论是在采样过程还是检测环节，都存在误诊的可能，唾液或鼻拭子样本病原丰度不高在采样和运输过程中降解也是导致其不可靠的原因之一。
在猪场首次出现唾液或鼻拭子核酸阳性结果时，本着宁可信其有的观点，可以先对猪只进行隔离，并在2～3天后对这些猪只采集血拭子复查。采用血拭子检测的风险性相对较小，一方面非洲猪瘟感染早期不会出现凝血不良；另一方面，血拭子采集的方法出血量是可控的，不会造成大面积污染。病毒在血拭子中受外界干扰少、病毒载量高、更可靠；需要在隔离期内对猪舍做好相应的消毒措施；
（3）养殖集团应建设标准化的中心实验室
荧光定量PCR非常敏感，容易受到气溶胶的污染，可靠的硬件设施是结果准确的保障。养殖集团可参照2010年农业部颁布的《兽医实验室生物安全要求通则》的要求建设实验室，其中PCR实验室应该由四分区组成，四分区有独立通风和空调系统，设定缓冲区和气压流向更有助于降低实验室上游污染的概率。养殖集团的中心实验室可作为仲裁机构，对结果进行最终的确认，并开展对体系内的区域实验室的盲评，有以便于建立更可靠的检测系统；
（4）区域实验室可通过改造通风设施降低气溶胶污染
1）实验室设计按试剂配制区、样本制备区、PCR扩增区进行物理性分区，每个区域都要保障独立通风，对于PCR扩增区更需要设置大功率排风扇不间断的将气溶胶排出试验区域；
2）加样和试剂配制需在生物安全柜里完成（非超净工作台，超净工作台仍然是气体内循环的，不能有效清除气溶胶），如没有生物安全柜，通风橱是高性价比的解决方式；
3）下班后实验室需保持密闭状态，需关闭排风扇，打开紫外灯，以消除环境核酸污染；
4）实验室内需定期消毒，除用紫外线照射外，可用氯制剂如84消毒液去除试验台和地面的核酸污染；
5）移液器、离心机均可用稀释后浓度为30%的84消毒液擦拭，但在消毒后需用清水反复擦洗干净；
6）选择有内参的检测试剂，通过内参曲线可监控实验操作人员的操作是否规范。此外内参的Ct值及曲线可反馈PCR反应的效率，可降低由于样本抑制PCR反应但被误判为阴性的可能。
7）实验室需准备2～3种试剂盒，一旦疑似假阳性时，可先用另一种试剂进行复核，如另一种试剂盒检测为阴性，极有可能是存在PCR产物的气溶胶污染。需从硬件设施，操作、耗材（如PCR管是否密闭性良好）等方面找到污染的原因。
过度检测是对检测资源的浪费，日常监测应重点在外围监测和对异常猪的确诊上。即使是在紧急情况下，也需要专业人员在充分了解猪场现状的前提下，根据统计学制定相应的检测方案，合理的采样发挥检测的效能。
为了保证检测结果的可靠，兽医应加大对基层采样人员的采样流程培训和监督考核，让生产体系和检测体系形成合力。在硬件设施上，建设标准化PCR实验室是降低污染的基础，养殖集团需要建设高标准的中心实验室作为终评机构。
相信在2020年我们必然在非洲猪瘟防控体系上更上一层楼，养殖集团会以检测数据为基础，更为合理地进行风险预警与猪群排查，在定点清除中的方案会更精准、更有效、损失最小，这需要检测中心将数据统计和临床工作相衔接，这更需要两个体系深度的融合。坚信中国养殖人的聪明才智和不懈努力，最终能战胜非洲猪瘟。
专家点评
自非洲猪瘟传入国内后，我们很多猪场逐渐意识到检测和监测的重要性，并陆续建立了各自的检测实验室。基于对非洲猪瘟传入风险的分析，我们对关键风险点进行监控是非常有必要的。在具体的工作中，我们需要注意以下三点：第一、强化针对非洲猪瘟的生物安全流程设计，注重清洗、消毒效果的评估。检测、监测是为了及时发现可能存在的风险，逐步优化和改善工作流程，建立科学合理的标准操作程序。一旦流程建立，就可以采用编组抽查的方式进行采样和检测，避免过度检测而造成实验室超负荷运转、检测人员打疲劳战。第二、实验室的检测结果是疫病诊断的一种重要的参考，但不是唯一的依据，还需要结合生产实践、流行病学调查、临床表现、病理病变等进行综合判断。第三、我们要充分认识实验室检测的局限性。检测结果经常会受到临床采样、样品的运输保存、检测方法、操作过程、实验室布局等方面的影响，可能出现假阳性或假阴性的结果。
本文作者陈家锃博士结合其临床抗非经验，提出“过度检测，适得其反——检测在非洲猪瘟防控中的科学应用”。首先，他强调要依据统计学规律，根据猪群分布特点和疾病传播特点制定科学的采样方案，并关注环境污染（如气溶胶）。不恰当的过度检测会导致检测效率降低，时间、金钱投入多，导致检测结果的错误。其次，他提出如何科学采样、合理配置资源，不仅“授之以鱼，还能授之以渔”。最后，针对实验室检测，提出关注采样流程、设备配置、疫病诊断、实验室标准化和气溶胶污染等方面，以提高检测结果的可靠性。希望大家尽可能做到精准检测、持续提升、管控风险、助力抗非。
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