10+免疫纯生信是如何炼成的
大家好，今天要和大家分享的是2020年2月发表在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（IF=10.252）上的一篇文章
文章名：Identificationof tumor immune infiltration-associated lncRNAs for improving prognosis andimmunotherapy response of patients with non-small cell lung cancer
这篇文献中作者使用了常规肿瘤免疫预后模型套路，但选择lncRNA为研究对象，并通过差异表达分析等多种手段筛选出signature并构建肿瘤免疫预后模型，探索基于此模型评分的患者在临床、预后等方面的差异，以及模型评分值与免疫浸润和免疫治疗靶点基因的关联，证明模型的预后价值。这篇文献启发我们，同一种套路，使用不同的分子进行研究，可能会取得意想不到的效果。
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识别肿瘤免疫渗透相关 lncRNA，以改善非小细胞肺癌患者的预后和免疫治疗反应
一、研究背景
肺癌是男性和女性中最常见的癌症之一，占所有癌症死亡人数的四分之一。非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的组织学亚型，约占所有肺癌的85％。NSCLC的5年相对生存率最低，约为19％。NSCLC肿瘤微环境富含与临床结果相关的不同类型的免疫细胞，肿瘤渗透免疫细胞的定量分子特征日益被公认为是预测性的生物标志物。长期非编码RNA（lncRNA）与免疫调节NSCLC的肿瘤微环境具有功能相关性。然而，肿瘤免疫渗透相关的lncRNA及其在改善临床结果和免疫治疗方面的价值在很大程度上仍未得到探索。
二、流程图
三、结果部分
1、lncRNA在人免疫细胞中的表达全景（数据处理及基因筛选）
①从GEO、TCGA、CCLE等数据库获取NSCLC患者的临床信息和转录资料。
②将表达量前5%的lncRNA纳入候选lncRNA集，在这些候选lncRNA中，作者分析得到91个lncRNA在所有19种免疫细胞类型中通常表达较高，117个lncRNA在19种免疫细胞类型其中之一中表达强烈。
③作者分别计算了这208个候选免疫相关lncRNA的TSI（tissue specificity index）分数，以测量不同免疫细胞类型的表达特异性。
2、免疫浸润相关lncRNA signature（TILSig）的构建（构建模型）
①对在免疫细胞中广泛表达且TSI<0.2 的57个hklncRNA进行差异表达分析，确定了17个在免疫细胞系中上调且在NSCLC细胞系中下调的肿瘤免疫浸润相关lncRNA（TILncRNA）。
②作者对这17个TILncRNA在GEOGSE30219数据中进行了单变量Cox回归分析，发现其中有7个与患者总生存期（OS）显著相关。
③使用加权后的lncRNA表达量（权重由多因素Cox回归得到）构建预后模型，以调查17TILncRNA表达与患者OS之间的关联。
模型构建流程如下图：
3、确认TILSig与其他临床因素的相关性（结果验证）
①根据预后模型输出结果的中位数作为临界值将患者分为高低风险两组，生存分析发现低风险组相比于高风险组OS更高（下图A），五年生存率也显著高于高风险组。
②根据上述模型对患者生存情况的预测性能进行了ROC曲线分析（下图B）。
③展示TILSig值的分布以及患者生存情况及对应的TILSiglncRNA表达情况（下图C)。
④对高低风险组19种免疫细胞亚群进行了单样本基因集富集分析并绘制火山图，结果提示高TILSig分数与更少的免疫细胞浸润和更差的预后相关。(下图D）。
⑤使用TILSig评分将患者分为高低风险组后观测了OS和5年生存率的显著差异，并且对4个TILncRNA的表达数据计算了风险评分后再次进行观测，生存分析结果依然提示二者显著的总生存期和5年生存率差异（图A，B）。
⑥检验TILSig评分在不同的免疫亚型中的分布情况，发现其在5个亚型中的分布存在显著差异（下图C），进一步分析发现，TILSig中的有4个TILncRNA的表达情况也在5个亚型中有显著差异，结果提示TILSig与肿瘤免疫微环境存在密切相关(下图D)。
⑦作者还基于TILSig评分利用单因素Cox回归分析对另外17种实体肿瘤进行验证，发现结肠癌（COAD）和肾透明细胞癌（KIRC）数据的TILSig评分与OS存在相关（下表）。
⑧本文中作者使用无病生存期（DFS）作为衡量肿瘤复发情况的指标，在GSE30219和GSE31210中进行生存分析后发现高风险组的DFS较低风险组要差，5年无病生存率也更低（下图A，C）。ROC曲线分析发现TILSig对肿瘤复发预测的性能更好（GSE30219：AUC=0.607；GSE31210：AUC=0.618）（下图B，D）。结果提示：随着TILSig评分的升高，肿瘤复发的可能性也有随之升高的趋势。
⑨最后，为了研究免疫浸润与免疫检查点抑制剂（ICI）相关基因之间的关系，作者进一步研究比较了ICI基因在高低风险组中的表达模式，发现高TILSig的病人倾向于更高的ICI基因表达（下图A，B，C），而且在低风险组的病人中可以观测到PD-L1和CTLA-4的表达与预后相关（下图D，E，F）。结果证明了TILSig评分在一定程度上可以作为NSCLC患者免疫治疗疗效的指标。
四、小结
在这篇文献中，作者首先分析了lncRNA在各种免疫细胞中的表达全景，证明其在不同的免疫细胞中存在一定的差异，随后通过TSI分数，差异表达分析等手段筛选出了7个TILncRNA组成了一个风险评估模型。随后对模型的各项性能进行了评估，具体方式是使用模型输出值的中位数作为临界值将病人划分为高低风险组，然后在不同数据库中对比高低风险组病人的肿瘤免疫和预后差异，并分析了TILSig输出值与免疫细胞浸润，肿瘤复发以及免疫检查点抑制剂相关基因的关系，还对模型进行了ROC曲线分析，这些结果可以证明作者的模型在非小细胞肺癌患者预后及免疫治疗疗效方面拥有一定的预测性能。