【LorMe周刊】如虎添翼----当噬菌体疗法遇到基因工程
作者：李婷婷，南京农业大学博士在读。主要研究根际噬菌体-有益菌协同阻控青枯菌ARGs生物复合污染。
快速出现的噬菌体抗性以及天然分离的噬菌体宿主范围难以涵盖所有临床相关的致病菌株等原因限制了噬菌体疗法的效率。本文讨论了如何通过基因工程的最新进展来改进噬菌体疗法。文章首先概述了如何设计噬菌体受体结合蛋白及其相关结构域以重定向噬菌体特异性并对抗细菌宿主的抗性；然后总结了如何重编程噬菌体为原核基因治疗的载体，这些载体能够提供抗菌“有效载荷”蛋白，例如序列特异性的核酸酶，以靶向复杂微生物组中的特定细胞；最后对未来利用人工智能和机器学习方法设计下一代基于噬菌体的疗法提出了推测性展望。
噬菌体基因组工程概况
噬菌体的基因组工程大体可以分为两类，i)同源重组(HR, homologous recombination)，ii)基因组重启动，即激活噬菌体外源组装的合成DNA。基于重组的方法(图1a)是噬菌体基因组工程最常用的方法，即利用噬菌体基因组在侵染期间与细胞质编辑模板进行HR驱动的等位基因交换。目前，细菌CRISPR-Cas系统已经被改造成为一种用于对未修饰噬菌体子代进行负选择的编程机制，可有效地从重组噬菌体裂解物中富集稀有突变体，已知的I-E、II-A和III-A型的CRISPR系统已被用于靶向选择革兰氏阴性和阳性宿主细菌的重组噬菌体。基因组重启(图1b)是为了解决噬菌体基因产物可能毒害其宿主菌的问题，开发的一种在天然细菌宿主之外进行基因组组装的合成方法。技术依赖于通过转化相关重组(TAR)或体外酶促组装将中小型DNA片段组装成全长噬菌体基因组，然后转化为有能力在细菌宿主体内重新启动并组装成突变体的噬菌体颗粒。来自合成DNA片段的噬菌体基因组组装使灵活的工程能够在任何基因组位点引入突变、缺失或插入，易于扩展构建基因库，并且无需针对野生型序列进行选择。在宿主细胞外重新启动噬菌体基因组的新合成生物学技术消除了对DNA转化的需要，并使感染未知或未驯化宿主的噬菌体合成成为可能。
基因工程设计的噬菌体疗法
为了改善噬菌体疗法专一性的限制，基于先前验证的可调宿主范围的噬菌体库，合成生物学家现在正在研究基于广谱噬菌体的新型噬菌体疗法(图2a)。决定噬菌体宿主范围的主要因素是位于噬菌体吸附装置(基板)远端或尾纤维尖端的受体结合蛋白(RBP)。广谱噬菌体已经进化出扩展或切换宿主范围的策略，包括：i)RBP等位基因和域交换，ii)高突变区中的靶向RBP多样化，以及iii)多价RBP病毒粒子。目前，噬菌体宿主范围的成功改造案例是在T2、T4 和T7这些密切相关的噬菌体之间通过HR进行尾纤维交换来完成的。同时，实施高通量RBP多样化策略来筛选可以转移或扩大宿主范围的噬菌体RBP突变体，可为基因编辑提供更多的思路模版。
除了通过基因工程改变宿主范围外，噬菌体的抗菌能力可以通过原位生产的异源蛋白质来增强或调节，这一点通常被描述为遗传“有效载荷”(图2b)。例如，噬菌体已被设计为提供生物膜解聚酶和胶囊解聚酶、群体淬灭酶和具有跨属裂解活性的细胞壁水解酶的供体。受侵染的细胞在裂解时产生并释放这些蛋白质，然后作用于靶细胞或其附近的底物。
图2 工程噬菌体的类型
未来的噬菌体疗法设计方向
目前，大数据的出现和新型机器学习(ML)方法的开创性推动了生物和医学研究重大的技术进步。前文中合理的基因工程改造是以天然噬菌体系统为模型，在整合了ML最新进展的合成生物学方法之后，这可能会进一步推动噬菌体治疗成为一种可行的临床治疗。将组学与基于机器学习的生物信息学相结合的研究方法已经广泛应用于癌症和其他生物医学领域。就目前而言，任何类别的噬菌体最丰富的数据集都是包含超过3400个完整基因组序列的放线菌噬菌体集合。目前的一种研究趋势是利用来自此类数据库的噬菌体和细菌全基因组序列以及相应的实验确定的宿主范围信息来预测病毒-宿主相互作用(图3a、b)。同时，类似如使用宿主范围信息作为分类标签，这些类型的实验数据可以很好地作为结构输入数据来预测噬菌体-宿主相互作用(图3c)。
图3 大数据发展影响噬菌体基因工程示意图
文章由噬菌体疗法专一性的限制展开，概述了现有的噬菌体基因工程方法，就此展开描述噬菌体相关基因工程的拓展进程，多方面的噬菌体临床问题的解决方式，同时，预测了噬菌体基因库的构建会为大数据下的噬菌体基因工程提供坚实基础。依靠天然分离的噬菌体投入在临床实际使用时，现在面临着诸多问题，为了充分发挥噬菌体疗法的潜力，需要跨学科的方法。除了基因组工程、合成生物学、结构引导设计和机器学习，还包括许多其他领域，如药物配方和给药、药代动力学和免疫学等。文章基于噬菌体生物制剂的制造和应用与非禁止性监管框架相结合，为未来靶向性的噬菌体疗法描绘了一幅可观的蓝图。
论文信息
原名：Enhancing phage therapy through synthetic biology and genome engineering
译名：利用合成生物学和基因组工程加强噬菌体治疗
期刊：Current Opinion in Biotechnology
发表时间：2020.12
通讯作者：Samuel Kilcher
通讯作者单位：苏黎世联邦理工学院