【LorMe周刊】比较代谢基因组学揭示链霉菌抗生素生产神秘机制

作者：姚感，南京农业大学博士在读，主要研究链霉菌代谢产物对植物根系微环境的影响。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍植物免疫机制的进化论，原文于2021年发表在《PNAS》上。

导读

链霉菌基因组中包含大量编码抗生素活性次级代谢产物的生物合成基因簇(BGC)，但在通常条件下其中大部分都不能按照预期进行表达。为了研究其中的原因，作者借助几株亲缘相近的灰色链霉菌（Streptomyces griseus）进化枝菌株，通过研究其共有活性代谢产物多环内酰胺（Polycyclictetramate macrolactam，PTM）产生能力，得出影响链霉菌表达活性次级代谢产物的原因。出乎意料的是，除了通常人们了解的影响BGC表达因素，启动子区域的突变和全局调控子影响外，作者表明PTM产量还受到链霉菌内其他次级代谢产物生物合成途径的影响。同时，研究还强调了比较代谢基因组学是探究活性次级代谢产物表达的有效途径。

灰色链霉菌进化枝比较和揭示PTM隐藏遗传基础的理想模型

灰色链霉菌进化枝具有揭示BGC沉默机制的优势。首先，灰色链霉菌JV180高产PTM化合物，而灰色链霉菌IFO13350的PTM BGC是沉默的，并且将IFO13350的PTM BGC进行启动子重构后成功在异源宿主中表达相应产物，表明IFO13350的PTM BGC是具备编码功能的。其次，公共菌株库的灰色链霉菌进化枝菌株（JV251-JV258）基因组测序和JV180、IFO13350等菌株基因组比对显示灰色链霉菌进化枝的PTM BGC是直系同源的。这些同源的PTM BGC具有相同顺序的生物合成基因（ftdA、ftdB、ftdC、ftdD、ftdE和ftdF），并且紧邻其各自PTM BGC的染色体区域也具有相同的基因含量（图1A）。最后，研究中灰色链霉菌BGC中编码的PTM酶，具有较高的同一性。随后研究通过LC-MS/MS对供试菌株PTM产量进行测定（图1B），得出固体培养基上的PTM产量高于摇瓶液体培养物的PTM产量。

图1 灰色链霉菌进化枝PTM产生的差异与PTM启动子区域序列变异相关

(A)灰色链霉菌进化枝菌株中PTM基因簇由是保守的。 (B)不同菌株PTM产量。 (C)菌株ftdA基因上游500bp的进化树。该树表明JV180等菌株的P_ftdA序列与IFO13350等菌株P_ftdA形成两个分支。引入JV180 P_ftdA区域后非JV180等菌株的PTM产量(D)和ftdB转录丰度(E)提高。

PTM启动子序列异质性导致抗生素生产差异

灰色链霉菌进化枝PTMBGCs具有简单而保守的基因排列，并且基因间间隙较小，推测PTM BGC是由单操纵子操控（串联基因）。在JV180中，互补DNA (cDNA)基因间连接的PCR扩增证实了这一假设。随后对PTM BGC第一个基因(ftdA)上游的500个碱基（包含PTM BGC启动子区域）进行系统发育分析，发现其形成明显两组：一组由JV180等菌株组成，另一组由其余菌株组成(图1C)。为了测试P_ftdA区域的序列差异是否与转录相关，我们将JV180的原生启动子区域替换为本研究中其他10个灰色链霉菌分支菌株的相应区域后，观察到JV180 P_ftdA启动子比IFO13350等 P_ftdA产生更高的PTM和ftdB转录(图1 D和E)。这支持了高产PTM菌株可能是天然强的启动子的假设。

JV180PTM BGC启动子区域结构-功能比较

上述结果表明，灰色链霉菌PTM调控涉及直接位于ftdA上游(500nt)的顺式调控元件，但我们不能排除来自跨式调控元件的额外影响。为了确定这些菌株的PTM启动子结构，通过对菌株JV180 cDNA末端的循环快速扩增，绘制了其转录起始位点(TSS)。推测的TSS是预测ftdA起始密码子上游的195-nt胞嘧啶残基。可能的−10和−35区被分配基于既定的间距 (图2A)。-35 box和TSS之间的高序列保守性(82.4 ~ 100%的序列同源性)表明，所有检测的灰色链霉菌分枝菌株都具有相同的核心启动子（-35、-10和TSS）。

图2 P_ftdA的定位和通过敲除分析鉴定顺式调控元件

(A)JV180 P_ftdA区域图，P_ftdA上游敲除的区域如图所示。 JV180 P_ftdA的上游区域缺失突变体的相对PTM产量(B)和ftdB转录丰度(C)。

为了更好地解析P_ftdA启动子结构并预测的-35框上游是否存在顺式调节特征，在JV180中创建了该区域的一系列敲除实验（图2A）。这些缺失突变体中的PTM转录和产生基本上不受影响，除非假定的-35框被破坏（图2B和C）。这证实了JV180 -35框的位置，并表明该区域缺乏任何关键的监管残基。此外，我们观察到所有研究的灰色链霉菌进化枝菌株在该区域上游的高度可变序列保守性（38.2至97.8%的成对序列同一性）。这与在核心启动子区域中看到的更严格的序列保守性形成对比。

AdpA积极调节灰色链霉菌分支的PTM BGC

AdpA是一种全局调控因子，参与灰色链霉菌形态分化的分级控制、链霉素和其他抗生素的产生以及其他几个重要过程。染色质免疫沉淀测序和RNA测序数据表明AdpA可能结合IFO13350的PTM BGC上游。研究通过AdpA敲除和回补、突变P_ftdA中假定的AdpA结合位点和体外结合测定，研究AdpA是否调节P_ftdA。JV180敲除AdpA 后，PTM产生和BGC转录也消失，异位回补AdpA后恢复，但组成启动子PermE*驱动PTM BGC的表达，而不依赖AdpA(图3A和B)。这些结果表明AdpA是P_ftdA的转录激活剂。

AdpA-DNA共结晶研究表明，该蛋白质作为识别高度可变基序的同源双链体结合目标操作符，其中包含四个核心不变的鸟苷和胞嘧啶核苷酸（图3C）。在这里研究的所有灰色链霉菌进化枝P_ftdA启动子中，这些不变的残基是完全保守的，在这些核苷酸中的任何一个引入颠换突变都会取消JV180PTM的产生和转录（图3C-E）。体外的使用重组组氨酸标记的AdpA直接结合JV180和IFO13350中的P_ftdA，也正证实了AdpA-P_ftdA相互作用（图3F-H）。同时也表明AdpA操纵子不是P_ftdA JV180和P_ftdAIFO13350之间PTM表达差异的主要原因（图3D和E）。

图3 AdpA是PTM表达所必需的，它在体内和体外直接结合P_ftdA

JV180的相对PTM产量、其ΔadpA突变体，以及由AdpA或用组成型PermE*替换PftdA对PTM产量(A)和ftdB转录丰度(B)。 (C)P_ftdA-AdpA结合位点的比对，非保守核苷酸以红色突出显示。 JV180P_ftdA-AdpA结合位点突变体的相对PTM产量(D)和ftdB转录丰度(E)。 His标记的JV180 AdpA与JV180 P_ftdA结合位点(F)、IFO13350 P_ftdA结合位点(G)和核苷酸直接与AdpA相互作用(H)。

比较启动子分析揭示了一个可调节P_ftdA强度和PTM产量的Indel“开关”

除了AdpA操纵子外，JV180 P_ftdA 5'UTR敲除实验表明TSS和AdpA结合位点之间的28个核苷酸对于PTM表达也很关键（图2B-F）。该区域启动子之间的核苷酸比对显示出普遍高度的保守性，除了存在于所有JV180 P_ftdA中但在IFO13350P_ftdA中缺失的两个核苷酸(AG)（图4A）。通过从JV180中敲除此AG二核苷酸，并在IFO13350 P_ftdA中的相应位置引入二核苷酸(IFO13350+AG P_ftdA)，来测试该插入缺失对PTM调节的影响。与IFO13350 P_ftdA序列相比，二核苷酸缺失导致PTM产生和转录强烈减少，回补的IFO13350+AG P_ftdA插入变体导致JV180PTM产生和转录显著增加（图4B和C）。总之，这些数据表明，在该区域的天然序列变体中，具有AG二核苷酸对PTM生产很重要。这些数据清楚地揭示了该插入缺失区域是调节天然灰色链霉菌进化枝P_ftdA强度的关键因素，并需要进一步的工作来辨别这个插入缺失区域如何调节启动子强度。

图4 保守的AG(G)indel调节强和弱P_ftdA

(A) TSS和AdpA结合位点之间的保守AG indel。 JV180 P_ftdA ΔAG突变体和JV180 ΔP_ftdA::P_ftdAIFO13350 AG突变体的相对PTM产量(B)和 ftdB转录丰度(C)。

Grisorhodin的生物合成可提高JV180菌株中PTM的产生

使用物种水平上的比较基因组学探究链霉菌抗生素生产，是天然产物功能基因组学中新颖的研究方法。借助灰色链霉菌进化枝菌株比较基因组学我们发现JV180组菌株产生的红色素在其他研究的进化枝菌株中不存在。通过比较BGC分析和敲除验证，验证色素产生是griseorhodin聚酮化合物基因簇表达产生（图5A）。出乎意料的是，griseorhodin BGC缺失突变体表现出几种额外的表型，包括PTM产量下调、PTM BGC转录下调和孢子形成减少（图5B和C）。

为了测试griseorhodin(grh)是否充当信号分子，研究敲除了四个编码griseorhodin聚酮合酶(PKS)的基因(ΔgrhQSAB)（图5A）。这样做是为了特异地消除griseorhodin的产生，同时保持所有其他grh BGC基因完整。但结果表明突变体高产PTM，这个结果否定了信号分子假设。同时测试了富含griseorhodin的JV180生长提取物和γ-红霉素（一种griseorhodin类似物）化学补充ΔgrhR2-V菌株的PTM产量。两个突变体都不能恢复PTM产生，这些结果共同否定了griseorhodin作为信号分子假设。

图5 JV180 griseorhodin BGC的缺失对PTM的产生和P_ftdA的转录产生负面影响

(A) JV180 grh BGC的图表，相应的彩色条的各种突变体中敲除基因范围。JV180 rpsL（白色背景）和JV180 ΔP_ftdA::P_ermE*背景菌株中各种grh突变体的相对PTM产量(B)和ftdB转录丰度(C)。

为了继续探测grh基因簇在grhQSAB之外的关键PTM影响基因，从grh BGC中敲除了多组基因（grhR1-E、grhFGH和grhI-P；图5A）。所有三种突变都导致griseorhodin色素表达完全丧失，PTM转录和产生降低（图5B和C）。基因grhR2和grhR3编码可能影响调节串扰的转录调节因子，grhF编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，而grhGH编码乙酰辅酶A羧化酶的β和e亚基。结果表明一个尚未发现的转录调控相互作用将两个BGC连接起来。目前研究正在进一步的进行，以更全面地描述这种BGC交互作用的发生。

结论

研究利用灰色链霉菌进化枝菌株，关联PTM产量和PTM BGC，明确了PTM高产和低产菌株的基因组特征。明确了PTM原始启动子P_ftdA可以调控PTM产量，同时表明全局调控因子AdpA可以通过以非典型方式结合P_ftdA启动子区域而直接调控PTM的生产。并且表明转录起始位点附近-10区和启动子之间的2-3bp突变也可导致转录强度和生物合成产量的显着差异。最后还发现，在JV180菌株中，PTM生产和转录都需要编码griseorhodin生产的BGC。这种关系可能涉及grhGH编码的丙二酰辅酶A，但需要进一步研究以揭示明确的机制。依赖griseorhodin BGC的PTM生产机制是令人惊讶的，并为通过敲除BGC构建简化基因组底盘菌株提供了一个罕见的、值得警惕的例子。总之，研究结果表明，菌株JV180看似简单的单调控因子的PTM BGC似乎受到高度复杂的控制，增加了其他链霉菌中日益增多的类似复杂BGC调控网络和机制。关于链霉菌中这些类型的调控网络还有很多需要继续探索以更全面地了解，用来支持合理的药物发现和生产。

论文信息

原名：A comparative metabologenomic approach reveals mechanistic insights into Streptomyces antibiotic crypticity

译名：比较代谢基因组学揭示链霉菌抗生素生产神秘机制

期刊：PNAS

发表时间：2021.02

通讯作者：Joshua A.V.Blodgett

通讯作者单位：伊利诺伊大学香槟分校