【衡道丨干货】不做第二个「黑豹」——结直肠癌肿瘤出芽解读
电影《黑豹》男演员查德维克·博斯曼（Chadwick Boseman）的逝去令所有人震惊，他选择默默地与结肠癌战斗，却从未与他人倾述。美国《赫芬顿邮报》的马修·雅各布斯（Matthew Jacobs）回忆起他3年前对博斯曼进行的一次采访，当时他对博斯曼在《马歇尔》和《黑豹》之间的体型变化感觉不可思议，而博斯曼则笑着回答说：「One day I’ll live to tell the story」。
查德维克·博斯曼《黑豹》剧照
结直肠癌是我国和美国第三大最常见的癌症，美国癌症协会建议大众在45岁时进行首次结肠镜检查。近年来，结直肠癌的发病人群有年轻化趋势，如「黑豹」博斯曼39岁被确诊为结肠癌。因此早期诊断结直肠癌、评估结直肠癌的预后因素迫在眉睫。2020版中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌诊疗指南已于今年四月更新，本次更新在病理形态学方面增加了一个非常重要的参数，即肿瘤出芽（Tumor Budding），是II期结直肠癌生存率的独立预测因子，本文针对肿瘤出芽的判读方法进行深入解读，准确判读该预测因子对结直肠患者的生存率尤为重要。
肿瘤出芽的定义是在结直肠癌浸润侧前沿处的间质内散在单个细胞或多达四个细胞的细胞簇，并且可以分为肿瘤浸润侧前沿出芽（PTB）和肿瘤内出芽（ITB），是结直肠癌中公认的独立预后因素。PTB只能在内窥镜或手术切除标本中评估，而ITB可以在结直肠癌活检和切除标本中评估。ITB和PTB都是上皮-间质转化（EMT）的形态学表现。研究表明，ZEB1，SNAIL1，TWIST1阳性微环境与肿瘤出芽表型有关。此外，肿瘤出芽可出现E-钙粘蛋白的表达缺失，并表达激活的wnt信号通路的标记物，例如核β-catenin和APC。此外，肿瘤出芽还可以表达基质金属蛋白酶（MMP），cyclin D1，VEGF和p16，但Ki-67并未显示核增殖指数升高。另外，肿瘤出芽还可能表达干细胞标记，例如EpCAM和ABGC5。淋巴结阴性结直肠癌患者的肿瘤出芽中存在ABCG5的表达与预后较差有关。
近二十年来，国内外病理学界不断有学者对肿瘤出芽进行研究，但一直缺乏标准化的评估方法。2015年3月，在美国波士顿举行的美国和加拿大病理学会（USCAP）年度会议上发起并成立了国际肿瘤出芽共识指导委员会（ITBCC），该会议于2016年4月27日至29日在瑞士正式举行，会议由来自11个国家的成员参加（分别来自美国、加拿大，日本和欧洲的25名具有肿瘤出芽专业知识成员，包括22名胃肠道病理学家，2名外科医生和1名转化医学研究人员），会议的主要目的是在评估肿瘤出芽的标准化评分方法上达成共识。ITBCC先后进了九轮会议，经过多方讨论，会议达成了以下11条共识：
共识1：肿瘤出芽定义为单个肿瘤细胞或最多4个肿瘤细胞的细胞簇
等级：强烈推荐，投票：22/22（100％），证据质量：高
证据与决策：
由于大多数研究都基于将肿瘤出芽定义为单个肿瘤细胞或最多4个肿瘤细胞组成的细胞簇之上，尽管也有研究使用了5个细胞的临界值。肿瘤出芽的预后能力并不受簇内细胞数目的影响。4个肿瘤细胞是目前使用最广泛的截止值肿瘤出芽的临界值，并且与新组织病理学参数「低分化细胞簇（PDC）」区分开来，后者被定义为5个或更多细胞。ITBCC小组同意以最多4个细胞来定义肿瘤出芽（图1）。
图1. 肿瘤出芽的示例，图a定义为单个肿瘤细胞或最多4个细胞的肿瘤细胞簇。图b定义为5个或5个以上肿瘤细胞的低分化肿瘤细胞簇。
共识2：肿瘤出芽是pT1结直肠癌淋巴结转移的独立预测因子
等级：强烈推荐，投票：23/23（100％），证据质量：高
在pT1结直肠癌中，需要可靠的局部淋巴结转移预测因子，因为它们的存在可能有助于选择在内镜切除术后进行根治性手术适应证。大量研究以及四项meta分析显示，肿瘤出芽是pT1结直肠癌局部淋巴结转移强而独立的预测因子。因此，ITBCC小组强烈建议报告pT1结直肠癌中的肿瘤出芽以及其他淋巴结转移的组织病理学预测因素，例如低分化，淋巴管血管浸润和黏膜下浸润深度。
共识3：肿瘤出芽是II期结直肠癌生存率的独立预测因子
等级：强烈推荐，投票：23/23（100％），证据质量 ：高
证据与决策：
UICC/AJCC TNM分期系统仍然是结直肠癌预后的金标准，并强烈影响辅助化疗的决策。一般情况下会对III期结直肠癌患者进行辅助化疗，II期患者则不需要（除非存在其它高危因素，例如肿瘤穿孔，淋巴管血管浸润，浆膜受累（pT4a），低分化的微卫星稳定性肿瘤，毗邻/不确定/切缘阳性，神经周浸润和淋巴结检出数量过少）。然而，某些II期结直肠癌患者的生存率较接受辅助化疗的III期结直肠癌患者要低。许多研究和meta分析表明肿瘤出芽是II期结直肠癌患者复发和存活的独立预测因子，具有类似于III期结肠直肠癌的预后。基于这些数据，ITBCC组强烈建议将肿瘤出芽纳入II期结直肠癌的高风险因素之中。
共识4：在多学科背景下，应将肿瘤出芽与其他临床病理因素一起考虑
等级：强烈推荐，投票：23/23（100％），证据质量：高
证据与决策：
除TNM分期外，还根据当前指南和诊疗方案常规报告预后因素，例如肿瘤分级（G），组织学亚型，血管浸润（V），神经周浸润（Pn）和切缘状态，甚至分子生物学标志物包括微卫星，KRAS突变和BRAF突变状态。根据现有证据，ITBCC小组认为肿瘤出芽的预后价值至少与V，G和Pn状态相同，因此建议将肿瘤出芽（Bd）与其他因素一起纳入结直肠癌风险评估的临床病理因素之中。
共识5：在HE染色切片上计算肿瘤出芽
等级：强烈推荐，投票：19/22（86％），证据质量：中等
证据与决策：
肿瘤出芽的预后数据主要基于对HE染色的切片评估的研究。有少量研究是通过免疫组化（IHC）来评估肿瘤出芽的。Meta分析表明，通过HE和IHC染色评估肿瘤预后情况并没有什么差别。有些研究发现IHC染色在观察者见重复性方面优于HE染色，而另一些研究则认为没有什么不同。ITBCC小组建议应根据HE染色评估肿瘤出芽，因为绝大多数预后数据均基于对HE染色的评估（尤其是在pT1大肠癌中）。此外，HE染色的成本低廉，即便是在全世界范围内，也能对肿瘤出芽进行评估。
在何种情况下使用IHC的方法呢？有时候，肿瘤出芽可能被肿瘤周围浸润的炎细胞掩盖，使得它们难以在HE染色上进行鉴定。另外，有时也很难将肿瘤出芽与间质细胞反应性增生区分开来。在这两种情况下，PCK的免疫组化会非常有帮助，尽管使用PCK的免疫组化染色之后，凋亡小体和细胞碎片也可以着色，此时不应将这些视为出芽。PCK可以更好地显示肿瘤出芽，但最终的肿瘤出芽计数必须在HE染色的切片上进行。
共识6：已证明肿瘤内出芽（ITB）在结直肠癌中与淋巴结转移有关
等级：强烈推荐，投票：22/22（100％），证据质量：低
证据与决策：
与传统或所谓的肿瘤浸润侧前沿出芽（PTB）相反，ITB是指主要从肿瘤体内出芽。尽管ITB和PTB这两个术语是在2011年引入的，但最初ITB的报道则是在1989年，在直肠癌活检中报道了ITB，并认为与淋巴结转移有关。最近在对应的结直肠癌切除标本研究中发现，术前活检组织中的ITB与高级别PTB、淋巴结转移和肿瘤消退等级相关。尽管ITB可能已被证明是结直肠癌患者术前管理中有希望的生物标志物，但目前尚无足够证据支持将其应用于常规病理报告。因此，ITBCC小组建议在常规工作中实施ITB的报告之前，需要对此领域进行进一步研究。
共识7：在肿瘤浸润侧前沿的一个热点区（视场面积为0.785平方毫米）中评估肿瘤出芽
等级：强烈推荐，投票：22/22（100％），证据质量 ：中等
证据与决策：
在临床工作中，生物标志物的标准化至关重要。目前在肿瘤出芽方面，有好几种不同的评分系统。虽然肿瘤出芽的预后意义在很大程度上并不依赖对出芽评估使用的评分系统，但有一个国际唯一的标准对于未来临床试验和诊断工作非常关键。为了确保显微镜视野面积大小的标准化，ITBCC小组建议按镜下面积报告（即平方毫米）而不是按照物镜（例如20倍），因为不同显微镜之间的视野面积差异很大。由ITBCC组中选择的视场面积是0.785平方毫米，其对应于日本学者上野秀城（Ueno Hideki）等人用的视场面积，被日本结直肠癌协会所采用（20倍物镜，20毫米视场数直径）。已经根据不同显微镜目镜视场面积对肿瘤出芽计算面积0.785 平方毫米进行了转换，形成标准化因数（图2）。
图2. 不同类型显微镜的肿瘤出芽数标准化转换表
共识8：对于结直肠癌的肿瘤出芽评估，建议采用「热点区」计数方法
等级：强烈推荐，赞成票：22/22（100％），证据质量：中等
证据与决策：
大多数研究都在一个肿瘤出芽密度最高的视野下进行肿瘤出芽计数（即「热点区」），而其他研究则使用了多个视野（例如「 5个高倍镜视野」和「10个高倍镜视野」 ）。多个视野计数的优点在于可以寻找整个浸润侧前沿中比较有代表性的区域，并且这种方法改善了观察者间的重复一致性。另一方面，计数多个视野可能会「稀释」最终（平均值）肿瘤出芽数量，以及灶状区域中多个肿瘤出芽的计数情况。因此，「热点区」方法可以更好地反映出肿瘤在侵袭性前沿浸润的最大程度。ITBCC小组建议使用「热点区」计数方法，因为这是绝大多数研究中使用的方法，并且使用此方法的观察者之间的一致率是完全可以接受的。但是，为了确保选择具有最高肿瘤出芽数量的区域，建议在对单个选定的「热点区」中的肿瘤出芽进行计数之前，先沿着肿瘤浸润侧前沿用20倍物镜扫描10个不同的区域。
共识9：应使用三级分级系统对出芽计数进行分级，以促进结直肠癌的风险分层
等级：强烈推荐，投票：23/23（100％），证据质量：中等
证据与决策：
对于肿瘤出芽计数的风险分层，大多数研究使用了数字化的临界值（包括两级和三级系统），而少数研究则使用连续量表来预测复发的可能性。由于肿瘤出芽表现为一个连续性的变化过程，连续性的量化方法可以提供更精确的风险分层。但是在临床实际工作中，设定临界值更为实用，并且没有足够的证据支持在临床决策中使用连续量表进行肿瘤出芽的量化。ITBCC小组建议使用日本结直肠癌学会所使用的三级系统：
0～4个肿瘤出芽-低级别出芽（Bd 1级）。
5～9个肿瘤出芽-中级别出芽（Bd 2级）。
≥10个肿瘤出芽-高级别出芽（Bd 3级）。
该系统允许对pT1期和II期的结直肠癌进行风险分层。对于pT1期结直肠癌，Bd 2和Bd 3与淋巴结转移的风险增加相关；而在II期结直肠癌，Bd 3与复发和死亡的风险增加相关。ITBCC小组建议，除了进行Bd分级外，还应报告绝对出芽数量，例如Bd 3（出芽计数17个）。这样可以避免在将临界值应用于分级情况时丢失信息。例如，出芽计数为9（Bd 2）的肿瘤，其生物学行为可能类似于出芽计数为10（Bd 3）的肿瘤，但却属于不同的风险分层。如共识4所示，在多学科诊疗中将肿瘤出芽与其他临床病理特征一起考虑是非常重要的。图3中显示了Bd 1、Bd 2和Bd 3的组织学示例。
图3 基于ITBCC 2016年结直肠癌浸润侧前沿的不同肿瘤出芽分级（热点区，0.785平方毫米）的示例。（a）：Bd 1（低级别），（b）：Bd 2（中级别）和（c）：Bd 3（高级别）。
共识10：报告结直肠癌的指南/方案中应包括肿瘤出芽
等级：强烈推荐，赞成票：23/23（100％），证据质量：高
证据与决策：
肿瘤出芽是结直肠癌中公认的独立预后因素，可能会影响pT1和II期疾病的临床决策（参见共识2和3）。ITBCC小组提出的国际标准化的、以循证医学为基础的肿瘤出芽计数方法夯实了用于常规病理报告肿瘤出芽的基础。因此，ITBCC小组建议在结直肠癌的病理报告指南和方案中应包括肿瘤出芽。
共识11：肿瘤出芽和肿瘤分级是不同的概念
等级：强烈推荐，赞成票：23/23（100％），证据质量：高
证据与决策：
肿瘤出芽是由浸润性前沿存在单个细胞或多达四个细胞的细胞簇来定义的（参见共识1），而肿瘤的分级则取决于肿瘤中腺体形成的比例。在多变量分析的研究中，证实肿瘤出芽的预后与肿瘤等级和生长方式无关。因此，ITBCC小组认为肿瘤出芽与肿瘤分级是不同的概念，且为具有预测价值。
在实际工作中结直肠癌肿瘤出芽其它需要注意的地方：在结直肠癌的某些组织学亚型中（例如黏液癌，印戒细胞癌，髓样癌和微乳头状癌），应谨慎评估肿瘤出芽。在黏液癌和印戒细胞癌中，不应计数漂浮在黏液池中的肿瘤出芽。在髓样癌中，继发于炎症的肿瘤细胞的崩解可能无法与真正的肿瘤出芽区分开来。在微乳头状癌中，应注意不要将分化差的细胞簇包括在肿瘤出芽计数中（见共识1）。最后，继发于严重（通常是富于中性粒细胞）炎症继发的腺体碎裂可能难以与肿瘤出芽区分开来。如果无法进行准确的肿瘤出芽计数，则报告里可以注释为BDX（肿瘤出芽无法评估）。
文末附上ITBCC 2016提出的肿瘤出芽计数操作步骤，用于在日常诊断中报告结直肠癌中的肿瘤出芽，请广大读者收藏。
（1） 根据图2中的转换量表，找出你的显微镜20倍物镜的视场数（FN）对应的视场面积
（2） 在该患者所有病理切片中选出肿瘤浸润侧前沿出芽密度最高的切片
（3） 在肿瘤浸润侧前沿用10倍物镜扫描10个不同的视野，找出「热点区」
（4） 在「热点区」内计数肿瘤出芽数量
（5） 将计算出的肿瘤出芽数除以标准化因数，即为0.785平方毫米面积中的肿瘤出芽数。根据出芽数进行Bd 1/Bd 2/Bd 3分级。
参考文献：
Alessandro Lugli, Richard Kirsch, Yoichi Ajioka,et al.Recommendations for reporting tumor budding in colorectal cancer based on the International Tumor Budding Consensus Conference (ITBCC) 2016. Mod Pathol,2017 Sep;30(9):1299-1311.