(一)16S测序的背景知识介绍

1. 基本介绍

1.1 宏基因组概念提出

宏基因组（Metagenome），也称微生物环境基因组（Microbial Environmental Genome）或元基因组。由Handelsman等于1998年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。包含了可培养和未可培养的微生物基因组，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。

1.2 宏基因组技术

(1) 扩增子测序(16S测序、18S测序、ITS测序等)；

(2) 样品全基因组测序。

2. 微生物与人类

(1) 生物的发展不一定都是进化，也可能发生退化；

(2) 一些研究发现，小基因组有可能由大的基因组退化而来；

因此，建议将这些物种的改变成为物种演化似乎更为合理。

3. 微生物的分类

(1) 原核生物：3菌(真细菌、放线菌、蓝细菌)+3体(支原体、衣原体、立克次氏体)；

(2) 真核生物：显微藻类、黏菌、假菌、真菌、原生动物；

(3) 古生菌：以前称为古细菌，但不一定出现的比细菌早；

(4) 病毒：无细胞结构的微生物。

3.1 微生物分类学

研究微生物分类理论和技术方法的科学称为微生物分类学。

(1) 分类(classification)：根据一定的原则(表型特征相似性或系统发育相关性)对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便考察和对未分类的微生物进行鉴定；

(2) 命名(nomenclature)：根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称；

(3) 鉴定(identification或determination)：指借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、新发现的或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。

3.2 微生物的分类单元

三域系统：细菌域（Bacteria）、古菌域（Archaea）和真核域（Eukarya）

域Domain 界Kingdom 门Phylum 纲Class 目Order 科Family 属Genus 种Species

-如果分类单元的等级不足以反映某些分类单元之间的差异时，可增加亚等级。

-物种进化可能是连续的，是定量的概念，而分类是定性的概念。因此，可能会出现出于中间状态的物种，比如一个物种既接近于A又接近于B。

-“种”指物种，目前生物学中，还是一个尚未解决的问题。高等生物中，指物种之间彼此杂交可以繁殖的自然族群。原核生物缺乏严格意义上的有性生殖，因此，很难确定种的概念。

3.3 原核生物“种”的概念

原核生物很难明确“种”这一概念。目前，一般讲DNA杂交同源性在70%以上，并且16S序列同源性达97%以上的菌株定义为同一个种。

3.4 微生物的命名

国际命名法，即采用林奈氏(Linnaeus)所创立的“双名法”。即，属名+种名加词。

如，铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa → 假单胞属+铜绿色的

3.5 指定属命名

泛指某一属细菌而不特指该属中任何一个种时，可在属后加sp.或spp.表示。分别代表species缩写的单词和复数形式。如，streptomyces sp.表示一种链霉菌(属)。

3.6 新种的命名

新种的命名，物种名后加“nov”(novel)：“ord.nov”新目、“gen.nov”新属、“sp.nov”新种。

4. 微生物鉴定方法

5. 16S物种分类

5.1 全基因组物种鉴定

(1) 当前的全基因组测序费用较高，单纯用于物种鉴定并不划算；

(2) 全基因组测序的数据，用于分析需要消耗非常多的计算资源，以及人力物力；

(3) 全基因组测序数据量大，比对需要消耗更多的时间，这对于一些微生物的快速检测显然是不利的；

(4) 目前微生物全基因组的数据库资源不够丰富，很多序列依然无法比对到数据库中。

5.2 扩增子测序：16S/18S/ITS测序

16S测序：从基因组上找到一段序列，具有很高的种间特异性，能够代表物种，就行身份证一样。

#胚胎重演论

5.3 核糖体rRNA

原核生物：5SrRNA(120)/16SrRNA(1540)/23SrRNA(2900)

真核生物：5SrRNA/5.8SrRNA/18SrRNA/28SrRNA

S：沉降系数，数值越大，核糖体序列的长度越长。

5SrRNA：序列太短，没有太高的唯一性；

23SrRNA：序列太长，不容易进行测序。

5.4 16S 物种鉴定的优势

(1) rRNA参与生物蛋白的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长过程中，其功能保持不变，所以序列保守；

(2) 在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适合用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；

(3) 16S rRNA分析相对分子大小适中，便于序列分析。1540左右的碱基，sanger测序测两端可以得到全长序列；

(4) 16S或者18S普遍存在于生物中，并且核糖体rRNA在细胞中含量大，便于提取。

5.5 16S测序与宏基因组测序

5.6 16S测序与宏基因测序的选择

(1) 首先进行扩增子测序，了解物种组成及丰度情况，估计meta基因组测序数据量；

(2) 参考扩增子测序结果，进行meta基因组测序。