质粒瞬转构建稳定细胞系？

稳定细胞系构建最常用的方法是采用慢病毒。那是否一定要采用慢病毒呢？答案是非必须的。采用质粒瞬转也能够构建稳定细胞系。下面就和细胞君一起熟悉质粒瞬转构建稳定系：

方法应用前题：目的细胞的瞬转效率?

细胞君曾多次转染极易转染的HEK293，细胞数量约2*10^{^6}个，最终能够存活的单克隆个数不到50，能够稳定表达外源基因的就更少了。基于此，我们就了解到转染效率越高，我们获得稳定细胞系的概率就越大；转染效率低的情况下如不足5%，细胞君建议同学们只能是尝试不要浪费太多时间纠结。

有的同学会问既然瞬转效率低，那我是否可以直接放大细胞量进行操作呢？理论是可行的，但要面临更大的工作量和成本。且转染效率太低，单克隆获得量的差别就是数量级，放大细胞量恐难以实现。

Tip: 同学们可以通过摸索转染试剂添加量、质粒添加量等条件转染目的细胞荧光表达对照质粒预实验得到最佳转染效率条件。

构建稳定细胞系具体方法：相信同学们都知道大概如下流程，我们只聊聊单克隆筛选阶段：

构建稳定细胞系流程：转染——单克隆筛选——扩增，检测——入库

1、 各操作时间节点

单克隆筛选铺板：转染后24h。因我们转染细胞密度较高，所以转染后24h要尽快铺板，防止细胞堆积状态变差。

单克隆筛选药筛：转染后48h。该时间节点为瞬转外源基因表达高峰，若细胞状态差放缓至72h再药筛。每3~4天，更换或补充含药培养基。

单克隆筛选扩增：筛选2~3周。单克隆形成的时间一般为2~3周。

2、各操作变量

单克隆药筛浓度：首轮药筛1/4~1/2的梯度药筛浓度。3~4天后，观察存活的细胞数量，如只有极少量单个细胞存活，此时可依据细胞状态更换为无药物培养基或1/4的药筛浓度以维持筛选压力。否则继续维持梯度的1/4~1/2药筛浓度筛选直至只有极少量单个细胞存活。

Tip：我们的目的是让整合的细胞能够存活，非整合细胞被灭杀，所以一定要梯度给药，只要有合适药物浓度筛选下的单克隆存活即可。

药筛浓度：细胞密度20%药筛3~4天100%细胞死亡的药物浓度。

单克隆铺板细胞密度：低于10%。因为转染细胞基量大，整合率低，需要将全部的细胞用于筛选。所以应控制筛选密度低于10%便于药筛。如果密度高，则不能完全灭杀非整合细胞或难以获得单克隆。

单克隆转移，扩增：单克隆细胞个数最少大于50个方可转移扩增，推荐转移至96孔板，以期提高初始细胞密度让细胞快速增殖。

以上就是细胞君对质粒瞬转构建稳定细胞系的经验，希望能够对初入此实验的同学们有所帮助哦！