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机体的免疫可以通过各种各样的方法抵御各种各样病原体的入侵，但是，病原体也可以通过各种手段来逃避免疫系统的攻击和追杀，实现它在机体内存活并伺机扩散的目的，也就是免疫逃避。
PD-L1和PD-L2是免疫检查点阻断的重要靶点（PD-L1编码基因CD274，PD-L2编码基因CD273），但肿瘤细胞如何实现其表达仍有待研究。本文确定了一个超级增强子(PD-L1L2-SE)，它负责PD-L1和PD-L2的过表达，诱导癌症中的免疫逃避反应，分析该超级增强子及其激活机制，将为理解免疫逃避机制的建立提供思路。
一、PD-L1和PD-L2在大多数肿瘤细胞和肿瘤组织中的共表达
在220个癌细胞系的RNA-seq数据中，95%的PD-L1阳性细胞系有PD-L2阳性表达；在5377个癌症组织的TCGA数据中，93%的PD-L1阳性癌症组织也有PD-L2表达(图1A)。同时发现与MCF7细胞相比，MDA-MB-231和SUM-159细胞中PD-L1和PD-L2的mRNA水平都要高很多(图1B)。
图1 PD-L1和PD-L2在癌症中同步表达
二、抑制超级增强子可显著降低PD-L1和PD-L2的表达
用JQ-1（已被证明能特异性地抑制超级增强子，对典型增强子的作用很小）处理SUM-159细胞，发现JQ-1处理显著降低了SUM-159和MDAMB-231细胞中PD-L1和PD-L2的表达 (图2A，B)。另一种超级增强子抑制剂I-BET-762在SUM-159和MDA-MB-231细胞中，也表明了对PD-L1和PD-2的抑制作用。流式细胞仪的结果同步验证了上面的结论 (图2C、2D)。表明PD-L1和PD-L2在癌细胞中的同步表达依赖于超级增强剂。
图2 抑制超级增强子下调了PD-L1和PD-L2的表达
三、信息分析揭示一个潜在的超级增强子(PD-L1L2-SE)位于PD-L1和PD-L2之间
在SUM-159中，PD-L1和PD-L2基因之间的DNA区域上发现H3K27ac高度富集，但在HBL-1细胞中却没有(图3A)。在SUM-159细胞系的chr9：5,495,000-5,505,000区域，BRD4和MED1的结合以及H3K27ac修饰位点都有最高的富集(图3B)。分析结果表明chr9：5,495,000-5,505,000(PD-L1L2-SE)区域可能是驱动PD-L1和PD-L2高表达的超级增强子 (图3C)。这些结果说明了PD-L1L2-SE是一个可能对PD-L1和PD-L2的表达起重要作用的潜在的超级增强子。
图3 调控PD-L1和PD-L2表达的潜在超级增强子
四、PD-L1L2-SE基因缺失显著降低PD-L1和PD-L2的表达
通过成功构建基因敲除细胞系（SgL1L2-SE），用来评估该区域的缺失是否影响PD-L1和PD-L2的表达。RT-PCR结果表明该DNA区域的缺失显著降低了PD-L1和PD-L2的mRNA表达水平(图4C)。WB结果证实PD-L1L2-SE缺失细胞中PD-L1和PD-L2蛋白水平的确降低了(图4D)。SgL1L2-SE细胞中PD-L1和PD-L2的表达也显著降低(图4E和4F)。免疫荧光显示PD-L11L2-SE缺失细胞中PD-L1的表达显著降低(图4G)。这些结果有力地证明了PD-L1L2-SE区域是在肿瘤中驱动PD-L1和PD-L2高表达的重要的超级增强子。
图4 PD-L1L2-SE对PD-L1和PD-L2表达的影响
五、PD-L1L2-SE超级增强子在肿瘤细胞PD-L1和PD-L2上调中的重要作用
RNA-seq数据鉴定到了34个高表达的基因，这些基因在PD-L1L2-SE缺陷细胞中显著下调(图5A)，其中CD274和CD273表现很突出。PD-L1L2-SE敲除后，PD-L1和PD-L2的表达几乎完全消失(图5B)。这一结果表明PD-L1L2-SE在PD-L1和PD-L2上调中起主要作用。JQ-1和I-BET-762处理均显著降低SgVec细胞PD-L1和PD-L2的表达，PD-L1L2-SE的缺失显著降低了PD-L1和PD-L2的表达(图5C)。这些结果表明PD-L1L2-SE是一个主要的超级增强子，它驱动了SUM-159细胞中PD-L1和PDL2的表达。
图5 PD-L1L2-SE缺失对PD-L1和PD-L2表达的影响
六、PD-L1L2-SE缺陷细胞对T细胞杀伤敏感
与对照细胞相比，PD-L1L2-SE缺陷的SUM-159细胞对T细胞介导的杀伤非常敏感(图6A和6B)。与对照细胞共培养的CD8+ T细胞中有很大一部分成为凋亡细胞(Annexin V+)，但是与PD-L1L2-SE缺陷细胞共培养时，CD8 T细胞的凋亡率大大降低(图6C和6D)。证明超级增强子诱导的PD-L1和PD-L2高表达在免疫逃避中的关键作用。
图6 PD-L1L2-SE缺陷细胞对T细胞杀伤变得敏感
七、PD-L1L2-SE在乳腺癌亚群中特异性激活
挑选了一组13个乳腺癌细胞系的H3K27ac的ChIP-sseq数据 (图7A)，发现只有在HER2阳性(HCC-1954)或三阴性乳腺癌细胞系(HCC-1937、MDA-MB-231和MDA-MB-436)中才能观察到PD-L1L2-SE的激活(图7B)。在T细胞中，PD-L1L2-SE处于失活状态(图7C)。通过对ATAC-seq数据的分析，发现PD-L1L2-SE(chr9：5,499,860-5,500,361和chr9：5,500,607-5,501,108)中ATAC信号的高表达与PD-L1和PD-L2的高表达相关(图7D)，说明已鉴定的PD-L1L2-SE仅在一小部分癌症组织中被激活，并且其激活与癌症患者中PD-L1和PD-L2的表达相关。
图7 PD-L1L2-SE在乳腺癌细胞亚群中被激活
PD-1/PD-L1(或PD-L2)已被证明是许多恶性肿瘤的首要靶点，包括黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、膀胱癌等。抗PD-1/抗PD-L1治疗的持久反应是有代价的，很大一部分患者会发生免疫相关副作用，包括罕见的致命性心肌炎。因此，了解PD-L1和PD-L2的调控机制将大大有助于设计更好的策略来克服耐药性，减少不良反应。