多重基因编辑构建新一代CAR-NK
近年来，自然杀伤（NK）细胞的CAR工程化由于NK细胞独特的生物学特性而获得了相当大的发展，使其成为肿瘤免疫治疗中极具吸引力的领域。NK细胞，即使通过基因工程表达CAR分子，仍保留其通过自身受体识别肿瘤细胞的内在能力，此外NK细胞不依赖T细胞受体（TCR）进行细胞毒性杀伤。这使它们与CAR-T细胞相比具有更有利的安全性。
在过去几年中，关于CAR-NK细胞产品的临床研究出现了前所未有的加速。在整个试验过程中，研究人员使用不同来源的NK细胞和各种模块化的CAR设计，针对多种靶抗原。总的来说，有两个主要趋势：首先目标疾病的范围发生了变化，虽然早期的大多数试验集中于血液系统恶性肿瘤，但最近许多的试验开始寻求探索CAR-NK细胞免疫疗法在治疗实体瘤方面的功效。第二，越来越多CAR-NK通过多重基因编辑方法去实现更复杂的结构设计，以增强NK细胞的效力和持久性，新一代的CAR-NK已暂露雏形。
除了将CAR-NK细胞重新定向到不同的靶抗原外，最近的研究重点已越来越转向基于不同跨膜和细胞内共刺激域的模块化组合的优化结构设计，以增强CAR-NK的效力。
如今，研究人员利用现有的多种基因工程能力，对CAR结构进行微调，以诱导更有效的抗肿瘤反应，增加抗原亲和力或延长体内持久性。已经研究了多种共刺激元件，包括来源于免疫球蛋白超家族（CD28、ICOS）、TNF受体超家族（4-1BB、CD27、OX40和CD40）以及其他包括CD40L和toll样受体（TLR）的结构域。与一些早期主要基于参与T细胞活化的共刺激结构域的CAR-NK结构相比，NK细胞特异性信号适配器的价值越来越高，DAP10、DAP12和2B4的作用尤为突出。
在一项研究CD19导向的CAR-NK的临床前研究中，加入DAP10（NKG2D的生理适配器）比单独使用CD3ζ信号的构建物增强了抗肿瘤效力。类似的，在其它研究中报道了通过将DAP12加入前列腺干细胞抗原（PSCA）靶向的CAR结构，以及将2B4加入间皮素靶向的CAR-NK细胞，结果均具有放大的抗肿瘤效力。
前三代CAR结构设计的调整均依赖于生理上发生的免疫细胞受体结构域。而被称为武装CAR的第四代结构采用了一种截然不同的方法，通过加入分子有效载荷，从而赋予CAR修饰的免疫细胞在任何生理免疫细胞受体中都找不到的额外特征和功能。这种方法使CAR结构能够被工程化，以解决细胞免疫治疗的一些固有生物学局限。
借助现代双顺反子和多顺反子载体平台，第四代CAR结构可以包含多个理想的基因修饰。目前最紧迫的生物学限制是在缺乏外源性细胞因子支持的情况下，体内持久性的问题。通过添加结构性转基因IL-15细胞因子，可以保持CAR-NK在体内的持续存在并增强抗肿瘤疗效。另外，通过添加可诱导的半胱天冬酶9（iCasp9）的分子安全开关，可以清除所有循环中的过继NK细胞，以防出现不良毒性。
尽管过继性NK细胞治疗取得了显著的成功，但免疫细胞耗竭仍然是一个治疗障碍。为了构建下一代的CAR-NK，NK细胞基础生物学也正在努力，以确定NK细胞免疫功能的负调节因子。已经发现一些检查点受体如PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT以及KLRG1在耗竭的NK细胞中表达上调。
NKG2A是最显著的抑制性NK细胞受体之一，它的基因缺失与NK细胞针对肿瘤的细胞毒性增加有关，阻断TIGIT也被证明可以防止NK细胞耗竭。此外，通过添加含细胞因子可诱导SH2蛋白（CIS），这是IL-15信号上游的一个关键细胞因子检查点，在CAR-NK细胞中实现了增强的代谢适应度和效应器功能。其他研究还包括PD-1/PD-L1和CTLA-4阻断对NK细胞的影响。
为了实现更好的抗实体瘤效果，下一代CAR-NK需要进行工程设计，以增强向肿瘤的迁移和穿透能力。一些研究正在加强NK细胞趋化因子受体的基因修饰，以使NK更有效地归巢到肿瘤部位。在肾细胞癌中，经修饰表达CXCR2的NK细胞表现出向疾病部位转运的改善。类似地，在EGFRvIII靶向的CAR-NK细胞上强制表达CXCR4可提高胶质母细胞瘤动物模型的存活率。
实体瘤的特点是具有高度的异质性，每个克隆都有其独特的免疫表型和抗原表达模式，单一抗原导向的细胞疗法往往面临巨大障碍，双特异性和多特异性靶向已经成为解决异质性带来挑战的一个有前途的方向。
一些研究已经在探索双靶点CAR-NK的应用，如对野生型EGFR和EGFRvIII都具有特异性的NK-92衍生的CAR-NK细胞。当异种移植模型中，双靶向CAR-NK细胞有效地抑制了肿瘤生长，提高了生存率，而与EGRF突变状态无关。另外，一种多特异性B7-H3靶向iPSC衍生的CAR-NK可识别多种实体瘤。
除了NK固有免疫检查点外，还有一些由肿瘤微环境引起的外在因素，为浸润免疫细胞创造了非常不利的环境。这些因素包括营养缺乏、酸度和缺氧的综合作用，以及免疫抑制细胞和免疫抑制因子的影响。
免疫抑制代谢物腺苷已知通过阻断NK细胞表面A2A腺苷受体（A2AR）影响NK细胞功能。A2AR敲除的NK细胞在BRAF突变黑色素瘤的异种移植小鼠模型中显示出增强的肿瘤控制作用。此外，通过使用CRISPR/Cas9靶向编辑TGFBR2基因，成功地使原代人类NK细胞对免疫抑制性转化生长因子β（TGF-β）产生拮抗。
目前，针对免疫代谢途径已成为一个有趣的概念，以使NK细胞更具代谢活力并保持其功能能力。在NK细胞中，IFN-γ的产生依赖于葡萄糖驱动的氧化磷酸化。一旦激活，NK细胞就会发生实质性的代谢变化，从而增加糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）的速率，以支持产生有效免疫反应所需的能量。
雷帕霉素复合物1 （mTORC1）在调节NK细胞代谢中起着关键作用，研究表明，CISH信号的破坏产生对CAR-NK细胞的代谢重组，从而保持升高的mTORC1和MYC活性，促进体内持久性和增强抗肿瘤活性。
在转录水平上，甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）和MYC已被确定为协调代谢适应的两个中央调节元件，使活化的NK细胞能够有效地启动免疫应答。MYC信号通过上调葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶的表达以及增加有丝分裂，使代谢机制适应NK细胞的特定需求。NK细胞中维持细胞内MYC蛋白水平的一种机制是通过糖原合成酶激酶3（GSK3）介导的磷酸化以及随后的泛素化和蛋白酶体降解，研究发现，GSK3的抑制可稳定NK细胞中的MYC水平，从而提高其抗肿瘤效力。
许多利用高度创新的下一代基因工程方法的CAR-NK细胞疗法正在探索中，以应对实体瘤的独特挑战，它们有望在短期内进入临床试验。支持这些发展的是对基础免疫细胞生物学的日益增长的理解，强大的多功能组学和单细胞分析技术越来越多地推动了我们在这方面的认识。随着基因工程能力的强大进步，这些见解将推动进一步的治疗创新，并随着时间的推移，从根本上改变当前的治疗模式，显著改善临床结果，造福于更多的癌症患者。
参考文献：
1.Engineering the next generation of CAR-NKimmunotherapies. Int J Hematol. 2021 Aug 28 : 1–18.