《自然·医学》：逆转免疫治疗耐药有新招！科学家首次发现，TIL过继细胞疗法可有效逆转非小对PD-1抑...
免疫检查点抑制剂（ICB）疗法虽然已在治疗非小细胞肺癌（NSCLC）中取得了不小的进步，但仍有很大一部分患者无法获益。与此同时，ICB联合疗法在临床应用中的效果也不太理想。例如联合铂类化疗时，临床数据显示大部分患者都会在12个月内出现肿瘤进展[1]。
这其中一个不可忽视的原因是：NSCLC是免疫学上的“冷”肿瘤，缺乏活化的肿瘤特异性T细胞，这可能会造成对ICB的原发性耐药。因此，晚期NSCLC急需更有效的联合疗法，将它变成对ICB敏感的“热”肿瘤。
对于这个难题，能调节肿瘤免疫环境的自体T细胞过继细胞疗法（ACT）或许是一种有效的解决方案。
此前已有研究表明，使用从患者肿瘤中提取的浸润淋巴细胞（TIL）进行过继细胞治疗，能让一部分转移性黑色素瘤患者获得临床收益[2]。实际上，TIL过继细胞治疗先前也曾在多种肿瘤中取得了一定的效果，包括胆管癌[3]，宫颈癌[4]，结直肠癌[5]和乳腺癌[6]；然而，这种方法尚未在转移性肺癌中开展临床试验。
前不久，来自杜克大学医学院癌症研究所的Benjamin C. Creelan领衔的团队，在著名期刊《自然·医学》上发表了重要研究成果[7]。
为了验证TIL过继细胞疗法是否可以逆转NSCLC对纳武利尤单抗的耐药性，他们设计并开展了首项晚期NSCLC患者的TIL联合纳武利尤单抗的1 期试验 (NCT03215810)。
论文首页截图
我们先来简单了解一下TIL过继细胞疗法是如何开展的。
这种治疗方式的前提是患者的肿瘤病灶可以进行切除活检。肿瘤组织从患者体内切除后，切成碎片，在高浓度细胞因子IL-2 环境下培养，以促进肿瘤组织中T细胞的生长。
值得注意的是，为了保证提取出的TIL不受ICB治疗的影响，Creelan和同事们选择在基线提取所有患者的自体TIL，而只有对一线ICB治疗产生耐药的患者会接受过继细胞治疗。
用于过继细胞转移疗法的TIL生成概念
这项临床试验总共招募了20名NSCLC患者。其中一半患者吸烟或有吸烟史。患者的中位年龄为54岁（年龄范围38-75岁）。所有患者中有40%无PD-L1表达，30%的患者有>50%的癌细胞表达PD-L1（中位表达为6%）。
测序结果显示，20名患者的中位非同义肿瘤突变负荷（TMB）为1.5/Mb（突变负荷范围为0.1-10.2/Mb）。其中4名患者携带EGFR突变。有一半的患者之前未接受过系统性治疗，大多数患者病灶较大。
这个临床试验中的主要终点是安全性，次要终点包括客观反应率，反应持续时间和T细胞持久性。
在本研究中，所有患者首先接受纳武利尤单抗的单药治疗，进展后，再考虑是否接受TIL ICB联合治疗。最终有16名患者接受了联合治疗，13名患者符合最终评估条件。
NCT03215810临床研究设计
总的来说，在13名可评估的患者中，11名患者肿瘤负荷减少，靶病灶中位最大缩小比例为-35.5%（变化范围为 20至-100%）。
值得一提的是，两名患者在1.5年后取得了持续的完全缓解，其中包括一名无吸烟史且肿瘤突变负荷低的患者。在ICB治疗中，这类患者由于难以产生肿瘤特异性T细胞而不被看好，而这项结果提出了一个有趣的可能性，即扩增可识别少量突变或癌细胞抗原的T细胞，可以逆转“冷”肿瘤的免疫环境，产生持久的ICB反应。
患者存活率和临床特性
考虑到患者在接受TIL过继细胞治疗之前还进行了体内淋巴细胞的清除（用环磷酰胺和氟达拉滨药物），研究人员想知道接受新的T细胞输入会对患者的免疫系统带来哪些影响，以及又有哪些T细胞对治疗产生了反应。
为了搞清楚这个问题，研究人员检测了TIL治疗后患者体内的肿瘤特异性T细胞，发现了能识别多种癌症突变的肿瘤特异性T细胞，而且在完全缓解的患者体内有更多的肿瘤特异性T细胞。在这些患者的外周血中，新抗原反应性T细胞克隆的数量也在TIL治疗后增加并持续存在。
在这个研究中，研究人员还在两名患者身上发现一些让人兴奋的现象。
其中一名携带EGFR6ΔEx19突变的患者（ID 25），对纳武利尤单抗产生了耐药性，但在TIL治疗后获得了完全缓解。后续分析发现，她的TIL过继细胞中不仅包含能够识别体细胞突变的T细胞克隆型，还包含了可以识别其肿瘤中异常表达的几种黑色素瘤相关（MAGE）癌-睾丸抗原（CTA）的克隆型。
这名患者在接受TIL过继治疗之后，有高达19种T细胞克隆型表现出了抗原特异性，并在体外活性测试中相对于对照平均数量增长了140倍。此外，这些T细胞克隆型在患者外周血中的水平也在治疗后显著增加，并维持了长达1年多的时间。
患者25接受TIL治疗后外周血中抗原特异性T细胞克隆型
另一名患者（ID 09）在初始纳武利尤单抗单药治疗期间出现了新软组织转移，对TIL过继细胞治疗产生了完全反应。此患者的三个突变引发了CD4 和CD8 TIL和外周血T细胞的反应性。与患者25一样，在接受TIL过继细胞治疗后，其肿瘤特异性T细胞克隆型的数量有显著的增长，而且这一现象在单独使用纳武利尤单抗治疗时并不明显。
患者9 的肿瘤治疗变化及TIL和外周血 T 细胞的反应性和克隆型
作者也进一步确认，与无反应者相比，TIL过继细胞治疗后，部分缓解或完全缓解的患者体内都发现了能识别肿瘤抗原的T细胞。值得注意的是，TIL过继细胞疗法包含了多种可识别肿瘤抗原的T细胞克隆型。
不难看出，这种多克隆型T细胞反应是通过多种基因突变和异常抗原表达抓住了狡猾的癌细胞，这或许就是逆转“冷”肿瘤免疫环境的关键。这也是TIL过继细胞疗法与重组单克隆受体的T细胞疗法（如CAR-T或TCR-T）相比在实体瘤治疗中的优势。
所有患者的肿瘤特异性抗原
那么这些促成联合免疫治疗应答的T细胞都有哪些表型呢？
接下来Creelan和同事们重点分析了过继治疗T细胞的终末分化标志物。他们发现，所有TIL均高表达Tim-3和TIGIT。Tim-3和TIGIT的表达可能会抑制1型辅助T细胞（Th1）介导的免疫反应并促进耐受。这些标志物间接代表了T处于细胞功能受损或持久激活的状态。此外，一些患者还有着有高比例的调节性T细胞（Treg）。
通过对记忆T细胞分化标记的t-SNE（t分布随机邻域嵌入）分析，TIL的表型主要由终末分化的CCR7-CD45RA-表型的效应记忆T细胞（TEM）组成。终末分化细胞的高比例可能是由于在IL-2刺激下的长期体外培养（≥7 周）造成的。
所有患者TIL记忆分化状态的t-SNE分布
与前面提到的T细胞数量增长相似，患者外周血中T细胞的表型也在TIL治疗后发生了持久转化，这种效果在初始纳武利尤单抗的单药治疗中并不明显。
为了测试种表型变化对于T细胞功能有怎样的影响，作者进一步比较了T细胞在TIL过继细胞治疗前后分泌细胞因子蛋白的能力。他们用多功能强度指数（PSI，一种衡量细胞疗法效力和疫苗效力的指标[8]）针对12种细胞因子进行了单细胞测量，测试了多达1000个CD8 和CD4 T细胞在免疫刺激下的反应。
相比于免疫治疗前和纳武利尤单抗单药治疗，经过TIL过继细胞治疗后的多个时间点提取的外周血T细胞都显示出了PSI的显著增加。表型分析显示，外周T细胞表型在治疗后取得了类似于过继治疗TIL的CD8 和CD4 TEM的特征，随后逐渐恢复初始T细胞表型，作者认为这一现象可能与免疫重建或持久的免疫激活有关。
最后，为了探究这一持久的免疫变化，Creelan和同事们检查了多个时间点中T细胞的受体β链的互补决定区（TRV-β，每个T细胞克隆型独一无二的受体基序，可以反映循环中每个克隆群的总数）。通过分析患者肿瘤和外周血样本的TRV-β测序结果，作者发现注入的TIL克隆型在很大程度上取代了患者的基线外周T细胞库，然后在随后的几个月中逐渐减少。
TIL过继细胞治疗后外周T细胞表型和基因型的变化
以上的1期临床试验深度分析了ICB联合TIL过继细胞治疗对晚期NSCLC患者系统性的免疫调节，并首次揭示了TIL治疗可以带来持久的肿瘤特异性T细胞反应。
总的来说，Creelan团队的临床试验表明，晚期NSCLC中自体TIL的细胞治疗通常是安全且具有临床活性的。TIL联合疗法对ICB耐药的NSCLC患者具有临床益处，并有部分患者获得完全缓解。这一重要发现进一步推动了晚期NSCLC的个性化免疫疗法。
需要指出的是，Creelan团队选择在患者首次接受ICB之前生成TIL，避免了ICB对TIL质量的潜在影响。未来还需要确定提取TIL的最佳时机，以及是否可以从对ICB产生耐药的肿瘤中分离出具有治疗活性的TIL。
参考文献
[1]. Addeo A, Banna GL, Metro G, Di Maio M. Chemotherapy in Combination With Immune Checkpoint Inhibitors for the First-Line Treatment of Patients With Advanced Non-small Cell Lung Cancer: A Systematic Review and Literature-Based Meta-Analysis. Front Oncol. 2019;9:264. Published 2019 Apr 16. doi:10.3389/fonc.2019.00264
[2]. Rosenberg SA, Yang JC, Sherry RM, et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2011;17(13):4550-4557. doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-0116
[3]. Tran E, Turcotte S, Gros A, et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4 T cells in a patient with epithelial cancer. Science. 2014;344(6184):641-645. doi:10.1126/science.1251102
[4]. Stevanović S, Draper LM, Langhan MM, et al. Complete regression of metastatic cervical cancer after treatment with human papillomavirus-targeted tumor-infiltrating T cells. J Clin Oncol. 2015;33(14):1543-1550. doi:10.1200/JCO.2014.58.9093
[5]. Tran E, Robbins PF, Lu YC, et al. T-Cell Transfer Therapy Targeting Mutant KRAS in Cancer. N Engl J Med. 2016;375(23):2255-2262. doi:10.1056/NEJMoa1609279
[6]. Zacharakis N, Chinnasamy H, Black M, et al. Immune recognition of somatic mutations leading to complete durable regression in metastatic breast cancer. Nat Med. 2018;24(6):724-730. doi:10.1038/s41591-018-0040-8
[7]. Creelan BC, Wang C, Teer JK, et al. Tumor-infiltrating lymphocyte treatment for anti-PD-1-resistant metastatic lung cancer: a phase 1 trial. Nat Med. 2021;27(8):1410-1418. doi:10.1038/s41591-021-01462-y
[8]. Precopio ML, Betts MR, Parrino J, et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8( ) T cell responses. J Exp Med. 2007;204(6):1405-1416. doi:10.1084/jem.20062363
责任编辑丨BioTalker