高效液相色谱的流动相与色谱柱注意事项

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，根据各物质分配系数的差异，实现各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

高效液相色谱刘路图

高效液相色谱法（HPLC）具有其他色谱法无可比拟的优势，具有检测速度快、分离效能高、检测灵敏度高、选择性好、应用范围广等特点，广泛应用于食品、药品检测和临床分析等方面。流动相、固定相是决定物质能否被高效分离的关键因素。

一、影响流动相的因素

1、pH 值的影响

流动相的pH 值应控制在２ ～ ７ 之间。当pH值大于７ 时可使硅胶载体溶解；当pH 值小于２ 时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系

统中需使用pH 值大于７ 的流动相时，应选用耐碱的填充剂；当需使用pH 值小于２ 的流动相时，应选用耐酸的填充剂。

2、缓冲盐的水相溶液的影响

含有缓冲盐的流动相应尽可能少用，必须使用时，缓冲盐的浓度应尽可能低，否则容易阻塞管路。由于十八烷基链在纯水相溶液中易产生弯曲，所以对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中水相溶液的比例通常应低于９５％ ，否则C１８ 链的随机弯曲将引起组分保留值变化，导致色谱系统的重现性很差。

3、流动相的组成比例、变化幅度的影响

流动相的成份不能随意改变，但是比例可适当调整。每次调整流动相组成比例时，以组分比例较低者（小于或等于５０％ ）相对改变量不超过± ３０％且绝对改变量不超过± １０％ 为宜，如４０％ 相对改变量的数值超过３０％ 时，则绝对改变量以± １０％为宜。

4、流动相的保存期限

配好的流动相都有一定的保存期限，因此为避免流动相变质而导致浪费，建议根据实际实验情况和有效期，合理配制一次所需的用量。在将配制好

的新鲜流动相倒入储液瓶前，需先将储液瓶润洗３次。然后把填写好的《储液瓶标签》（内容包括流动相成分、配比、配制人、配制日期及有效期等信息）粘贴到储液瓶上。

二、影响色谱柱使用寿命的原因

1、 色谱柱筛板问题

筛板位于色谱柱的入口处，容易发生堵塞。筛板堵塞会产生柱压升高、色谱峰拖尾、塔板数降低等问题。样品中含有微粒是导致筛板堵塞的主要原因。因此，为了避免此类问题的发生，必须在进样前将样品过0.45μm 的滤膜。

2、 强保留样品组分

强吸附性的样品组分吸附在柱头填料上，能严重地缩短色谱柱寿命。分析生物组织或体液（如血浆）的提取物、含油剂等复杂样品时，这种滞留组分的影响尤其严重。色谱柱应用中，色谱峰严重拖尾或分叉的出现往往是强保留污染物在柱头吸附的体现。在进样阀与色谱柱之间加／支保护性的小预柱，能够有效减少强吸附组分对色谱柱的污染。小预柱通常为填充良好的1~2cm 的短柱，内装有与色谱柱相当的填料。需要注意的是小预柱必须定期更换。

色谱柱分离过程

3、反相色谱柱的清洗与再生

常规样品污染的硅胶基质色谱柱，一般选用溶剂强度逐渐增大（极性逐渐减弱）的溶剂清冲洗，强疏水性的溶剂清洗非极性物质，如脂类。最常用的方法是用２０ 倍柱体积（柱体积指色谱柱内空腔体积，４.６x２５０mm 色谱柱的柱体积为４.２mL）的乙腈（或甲醇） ∶ 水＝ ９０ ∶ １０（V／V） → 乙腈→ 二氯甲烷→ 乙腈→ 乙腈（或甲醇） ∶ 水＝ ９０ ∶ １０ （V／V）冲洗色谱柱。需要注意的是在清洗和再生的过程中，需要保证每种清洗溶剂和下一种清洗溶剂互溶。当金属离子污染色谱柱后，必须使用特殊的溶剂（磷酸和０.１mol／L 柠檬酸）清洗色谱柱，才能得到再生。

4、正相色谱柱的清洗与再生

正相色谱柱的清洗与再生的方法与反相色谱柱相反，用极性逐渐增强的溶剂冲洗。常用的方法正己烷→ 异丙醇→ 二氯甲烷→ 甲醇→ 二氯甲烷→异丙醇→ 正己烷冲洗，每种溶剂不少于２０ 倍柱体积。