PCR异常曲线原因分析及解决方法

异常曲线1:PCR扩增抑制

原因分析:

H07存在扩增抑制

解决方案:

将样本稀释后进行扩增(抑制物的影响可通过稀释样本消除)

异常曲线2:自动基线设置问题

原因分析:

自动基线问题

解决方案:

手动设置基线。将Baseline End设置为“扩增信号出现的前一个循环”即,图片展原始为26,将其设置为20,点击OK即可恢复正常曲线。

异常曲线3:荧光定量PCR实验结果中无Ct值出现

原因分析:

(1)PCR参数设置错误:在设计循环参数时没有设置荧光信号采集;

(2)模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况;

(3)引物或者探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性;

(4)电脑设置了自动休眠。

解决方案:

按照原因分析进行一一核查,对症处理。

异常曲线4:斜直线型扩增曲线

PCR实验首次检测呈斜直线型扩增曲线,再次复检后结果基本均为正常阴性。

原因分析:

  • 分液不准确,检查检测后的反应管可发现管内的PCR反应液量明显少少于正常管;

  • 反应管气密性差,反应过程中溶液蒸发引起探针浓度增加,导致曲线呈斜直线状。

解决方案:

  • 分液均匀,上机前检查八连管液面是否在同一水平线上;

  • 八连管盖盖严,上机前检查是否有缝隙。

异常曲线5:扩增曲线末尾起跳

PCR实验结果中有曲线出现末尾起跳但是没有完整扩增的现象。

原因分析:

(1)阴参曲线末尾起跳,通常表示存在污染;

(2)复检样本,排除非特异性扩增的可能性;

(3)正常样本也可存在曲线末尾起跳,表示样本浓度低或者加样量不准确。

解决方案:

  • 排除是否存在污染;

  • 排除污染原因后复检样本,如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的末尾起跳为非特异性扩增,如果复检后曲线仍与之前一致则说明末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。

异常曲线6:山域型曲线

原因分析:

严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线,轻微的蒸发会是一种缓慢的上升,这两类异常的曲线可以看一下检测后的反应管液面是否有下降的现象来证明。

解决方案:

上机检测前检查八连管管盖,保证无缝隙后上机扩增。

异常曲线7:扩增曲线有向上或者向下的尖峰

原因分析:

(1)仪器不稳定导致的扩增曲线异常(也可能突然停电或者电压不稳);

(2)如果尖峰向下,可能是卤素灯老化所致发射光源不稳定(指卤钨灯光源的激发器)

(3)如果是单一的孔位出现尖峰,除了考虑仪器或者孔位问题外,还要考虑反应体系是

否有气泡所致。

解决方案:

按照原因分析进行一一核查,对症处理。

背景知识

判断扩增曲线是否良好的指标

1.曲线拐点清楚,特别是低浓度样本指数期明显,扩增曲线整体平行性好,基线平而无上扬现象,低浓度样本扩增曲线指数期明显。

2.曲线指数期斜率与扩增效率成正比,斜率越大扩增效率越高。

3.标准的基线平直或略微下降,无明显的上扬趋势。

4.各管的扩增曲线平行性好,表明各反应管的扩增效率相近。

(0)

相关推荐

  • PCR定量与微流控技术

    目前市场上的PCR产品主要是基于ABI开创的qPCR技术平台和荣研化学开创的LAMP技术平台,有的公司会在这两个技术平台的基础上进行研发创新,主要还是分成变温和恒温两大类,而对于PCR的定量功能实现这 ...

  • qPCR数据整理分析

    荧光定量PCR(qPCR)是实验室常用的一种技术,该技术可以应用于基因表达分析.基因分型. 病原体检测.SNP分析等.qPCR实验操作简单,原理易懂,但面对一堆凌乱的数据,如何进行结果分析成了最头疼的 ...

  • 高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书

    [产品名称]通用名称:高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)[包装规格]:作I者:疾控科研试剂博客联I系:I99I-4747-I94单管单人份,24人份/盒.[预期用途]本试剂盒适用于 ...

  • 荧光定量PCR专题:第二期

    荧光定量PCR专题:第二期--实验设计 2017-08-18 16:48 小V常常接到科研小清新们的咨询,大家都在苦恼qPCR实验无从下手,或者好不容易做出了结果,又无法判断结果是否真实有效-- 其实 ...

  • 聊一聊荧光定量PCR中的四个高频词

    现如今,实时荧光定量PCR技术(以下简称qPCR)在传染病检测.动物疫控.药物基因组学和生殖遗传等等应用领域已经成为一颗耀眼的明星,这些应用领域都是借助qPCR检测核酸靶标进行定性或者定量实验.现实应 ...

  • 致善Sanity 2.0技术剖析,超多重靶标检测王者!

    最近看到很多人都在转发厦门致善一体机Sanity 2.0拿证的消息,也有一些朋友跑来问我这个机器的情况,今天就专门给大家写一篇产品剖析文,希望能够对你有用. 致善Sanity 2.0这款机器,我最早看 ...

  • MPB:中科院深圳先进院戴磊组小鼠粪便样本中16S拷贝数的定量检测

    为进一步提高<微生物组实验手册>稿件质量,本项目新增大众评审环节.文章在通过同行评审后,采用公众号推送方式分享全文,任何人均可在线提交修改意见.公众号格式显示略有问题,建议电脑端点击文末阅 ...

  • 干货丨揭开数字PCR的面纱,认识一下“她”

    来源:小桔灯网 摘要 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)大流行导致了公共卫生危机和全球恐慌,到目前为止确诊人次已经超过二亿二千万例.Delta.Lambda新冠变异病毒已经出现在全球90多个国家.如 ...

  • 平台小知识vol.1:实时荧光定量PCR

    分子病理检测需要用到各种先进的数据处理分析仪器和软件,即大多数小伙伴会说的"平台",在核酸的层面上,对样本进行深度剖析,提炼最需要获得的信息,是这些平台所给予使用者的优质" ...

  • QPCR检测实验流程

    qPCR背景介绍 在实时荧光定量PCR中,对每一轮循环的荧光信号强度进行监测并记录,随着反应的进行,监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线,即为扩增曲线.一般而言,扩增曲线可以分成三个阶段:基线期(Bas ...

  • 警惕,新冠核酸检测失败可能是这个原因!

    作者:陈建林.吴莉红.吴良燕.梁思群.戴娟.沈月 单位:柳州市柳铁中心医院 案例发生比较典型,为了避免发生类似的问题,梳理原因分析过程并整理实验验证资料,与大家进行分享. 案例经过与原因分析 9月21 ...