【药化】GSK研究团队发现新型BET蛋白抑制剂
溴结构域蛋白（BRDs）是一种进化上高度保守的蛋白，可通过识别组蛋白的乙酰化赖氨酸残基并与之特异性结合从而参与调控基因转录和染色质重塑等生命过程。基于序列同源性，BRDs家族可分成8个亚家族，结构域和超末端结构域（BET）家族是其中研究最多的。BET家族由BRD2、BRD3、BRD4和BRDT组成，虽然BRD2、BRD3、BRD4和BRDT结构具有相似性，但它们的生物学功能具有一定差异。相关研究表明，BET家族不仅参与肥胖、肺纤维化、慢性阻塞性肺和癫痫等多种复杂疾病的发生和发展，而且在多种肿瘤中均存在高表达，参与肿瘤的发生、浸润和转移等过程。因此，利用小分子抑制BET蛋白被认为是治疗多种疾病的潜在治疗策略。
至今为止，BET家族的抑制剂主要包括二氮杂及其衍生物（I-BET762（1）、OTX015（2））、吡咯并吡啶酮类（ABBV-075（3））、喹啉酮类及其衍生物（RVX-208（4））和异噁唑类（I-BET151（5））等（Figure1）。目前暂未有BET蛋白靶向药物上市，在研药物也基本处于I/II期，用于治疗血液恶性肿瘤、实体瘤和心血管疾病等多种疾病。因此，研发靶向BET的小分子抑制剂是目前研究的新方向。
近日，GSK药物研究中心的Katherine L. Jones研究员团队基于先前报道的BET抑制剂I-BET151，对其进行结构修饰，发现了活性更为优异的选择性抑制剂I-BET282E。相关成果发表在J. Med. Chem.上（DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00855）。
（图片来源：J. Med. Chem.）
作者对临床在研化合物1和5的性质进行了研究（Table 1）。结果显示，相比于性质优异的化合物1，化合物5不仅对细胞色素P450（CYP）具有明显的抑制作用，且可能存在高肝清除率。相比之下，化合物5具有更大的优化空间。
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基于化合物5与BRD4的共结晶结构图（Figure 2），作者发现化合物5的二甲基异噁唑基团通过“水桥”与Tyr97残基的作用而与溴结构域的乙酰化组氨酸结合，这对于化合物活性具有很大影响。吡啶基与由Trp81、Pro82和Phe83残基侧链组成的亲脂性WPF区域存在相互作用，为了保持与WPF区域的相互作用，咪唑并喹啉骨架同样是至关重要的。此外，在咪唑并喹啉2位引入不同取代基或许可以改变其理化性质。基于此思路，作者提出设计策略：先对两个位置的取代基进行筛选，再结合两个优势基团或许能够发现高效、高选择性和溶解性优异的BET抑制剂（Figure 3）。
（图片来源：J. Med. Chem.）
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基于上述设计思路，作者尝试通过减少芳香环结构以增强其亲脂性（Table 2）。首先，将吡啶基替换成异丙基、异丁基、异戊基和环丙基得到化合物6-9，其蛋白和细胞活性均下降，同时伴随着LLE值的降低，说明化合物活性与亲脂相互作用存在密切关系。基于化合物8，作者插入氧原子得到醚类似物10，其LLE值显著增加，但活性略有下降。接着，作者引入一系列含氧环状基团得到化合物11-15，除化合物15外，其余化合物的蛋白和细胞活性及LLE均略有增加。此外，引入一些含氮基团得到化合物16-18，但相比于化合物5，其活性均下降。总而言之，作者通过对R1取代基的优化发现含有醚键的取代基能够使得化合物在活性和亲脂性间达到最佳平衡。
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紧接着，作者对R2基团进行了筛选（Table 3）。在R2位引入一系列烷基得到化合物20-23，相比于化合物19，其蛋白和细胞活性均显著提高，而LLE值同样出现不同程度的增加。引入氨基和含氧基团得到化合物24-27，相比于化合物19，其对BET均具有优异的抑制活性。
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基于对R1和R2取代基的筛选，作者结合优势基团对化合物活性进行了研究（Table 4）。保持R2位的甲氧甲基不变，在R1位引入含氧烷基得到化合物28-29，这两者具有良好的蛋白活性，但细胞活性较差。将R2位的吡喃环固定不变，在R1位引入环丙基和甲基丙氧基得到化合物30-31，其中化合物31的蛋白和细胞活性有所增加。基于化合物31，作者通过手性拆分得到单一对映异构体32和33，两者的蛋白活性相当，但R-对映异构体32的细胞活性更为优异。当R1为4-四氢吡喃基时，在R2位引入四氢吡喃基、二甲胺基和吗啉基分别得到化合物34-36，活性均较为优异。将R1的脂肪基替换成吡啶基分别得到化合物37和25，其中化合物37的活性更为优异。
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基于优化结果，作者研究了部分化合物对CYP2C9和3A4的抑制情况（Table 5）。结果显示，化合物5、35和37对CYP2C9和3A4存在明显抑制，而化合物32对CYP2C9、3A4抑制浓度分别为>50 μM和25.1 μM，表明化合物32的毒性可能会更低。
（图片来源：J. Med. Chem.）
为了理解化合物与蛋白的结合方式，作者对化合物32以及GSK788与BDR4蛋白的共结晶结构进行了分析（Figure 4）。与化合物I-BET151相似，二甲基噁唑基团与Asn140存在氢键相互作用，还通过“水桥”与Tyr97残基形成了氢键。咪唑并喹啉上的甲氧基甲基伸入WPF区域，其中的α-甲基与Leu92残基的亲脂性表面存在相互作用；四氢吡喃基团伸入到Trp81与Leu92残基形成的ZA通道内。而与化合物GSK788不同的是，化合物32并没有与D145残基形成相互作用，但因此也使得其对BD1和BD2均具有抑制活性。
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基于化合物32的CYP蛋白体外抑制情况，作者研究了其对CYP2C9和3A4的体内抑制活性（Table 6）。结果显示，相比于化合物I-BET151的高肝清除率，化合物32的代谢稳定性显著增加，且具有高MDCK细胞渗透性（346 nm/s）及良好的血游离分布（fub 0.1−0.2）。此外，对于多种CYP蛋白，化合物32的抑制活性均较低（>50 μM）。
（图片来源：J. Med. Chem.）
接下来，作者研究了化合物32在小鼠、大鼠和狗体内的PK性质（Table 7）。结果显示，其在小鼠和大鼠的全血清除率较低（<25%），而在狗体内的清除率达到了68%，与肝体外清除模式相似，所以作者认为化合物32在人体内可能具有良好的清除率。此外，化合物32在小鼠、大鼠和狗体内的口服生物利用度分别为51%、74%和31%。鉴于化合物32的可口服和低清除率的特点，可作为进一步研究的基础。
（图片来源：J. Med. Chem.）
基于化合物32的优异PK性质，作者考察了化合物32及其甲磺酸盐I-BET282E的口服PK性质（Table 8）。相比于化合物32，其甲磺酸盐的溶解度提高了20倍，说明其具有成为前药的潜力。从表中可以看出，在小鼠体内，I-BET282E的AUC0-t和Cmax均差于化合物32，但T1/2相当。而在狗体内，化合物I-BET282E的AUC0-t和Cmax几乎是化合物32的3倍，但其T1/2仅是后者的1/2。
（图片来源：J. Med. Chem.）
最后，作者对I-BET282E进行了体内抗炎症活性研究（Figure 5）。在Wistar大鼠关节炎模型中，随着给药剂量的增加，其临床评分显著下降，呈现出一定的剂量依赖性，且其1 mg/Kg剂量的效果与化合物I-BET151的3 mg/Kg剂量效果相当。
（图片来源：J. Med. Chem.）
小结：GSK药物研究中心的Katherine L. Jones研究员团队基于BET抑制剂I-BET151，对其进行结构修饰发现了体内活性更为优异的抑制剂I-BET282E。该化合物展现出一定的临床潜力，未来或许有望进入市场，为多种疾病的治疗策略提供新思路。