新发现！联合检测异倍体EMT CTC、EndoMT CTEC用于贝伐单抗治疗NSCLC的重要临床意义...
血管增生在肿瘤生成、进展、转移、耐药及复发过程中起着极为关键的作用。新生血管抑制剂贝伐单抗联合用药抗肿瘤已取得比单药更好的疗效。最新发表的广东肺癌研究所吴一龙所长牵头全国14家医院开展的多中心临床实验显示，贝伐单抗联合TKI厄洛替尼 (A T模式)可使具有EGFR突变的晚期非小细胞肺癌NSCLC (包括脑转移) 患者显著获益，可作为这类患者转移或复发时的一线用药[1]。因此，如何更加合理选择适于抗血管生成药物治疗的肿瘤患者及有效预测、评估疗效、实时监测肿瘤耐药已成为广大临床医生日益关注的焦点。
最近，首都医科大学附属北京胸科医院、国际著名的德国慕尼黑LMU大学医学中心及赛特生物，利用赛特SE-i·FISH在国际上首次联合深入研究了上皮型、间质型等异倍体循环肿瘤血管内皮细胞CTEC和CTC在贝伐单抗治疗NSCLC过程中的重要临床意义。获得的一系列重要成果投稿经严格审评后，无需修稿，直接被著名期刊Molecular Oncology接受发表[2] (影响因子 IF=6.603)。本文责任编辑为世界顶级CTC专家Dr. Klaus Pantel，第一作者为北京胸科医院张同梅主任、张丽娜研究员、高远主治医师，通讯作者为北京胸科医院李宝兰主任及赛特生物林平博士。
本文要点
由于受细胞内一系列调节作用的影响，mRNA阳性检出与其相对应的蛋白表达的实际吻合性只有40%[3, 4]，即mRNA检测阳性并不意味着一定会产生最终发挥重要作用的特定蛋白质[4, 5]，因此，作者利用SE-i·FISH技术，从染色体及蛋白表达层面，原位、联合检测4种型别的异倍体CTC、及4种型别的异倍体CTEC亚类细胞，从而为细胞分型提供了更加准确、眼见为实的可靠依据：
利用Cox回归分析，在以上8种型别CTC、CTEC中锁定具有高风险的亚类细胞，以指导进一步逐一分析其相关临床意义：
治疗前：基线含有间质型CTEC 的患者，疗效较差，但含有裸细胞CTEC的患者预后好，此发现将有助于区分、选择适于抗血管生成治疗的NSCLC患者；
治疗开始后：出现上皮型 CTEC、CTC或混合型CTEC的患者，提示肿瘤耐药及较快的肿瘤进展；但出现裸细胞型CTEC的患者，则显著获益，伴有明显延长的PFS。汇总如下：
新颖的“桑基分析”(Sankey Diagram) 为揭示携带CTC、CTEC各种亚类细胞的患者在治疗过程中如何通过EMT、EndoMT 相互关联及预后提供了可视性分析手段
CTC、CTEC总数：异倍体CTC及CTEC呈相似变化趋势；治疗后总数升高的患者，疗效差，PFS 及OS显著较短
有效区分及联合检测CD31- CTC及CD31 CTEC的各亚类细胞，才能更加合理选择适宜患者、准确预测、评估疗效、监测肿瘤耐药、转移与复发
正常二倍体CEC与肿瘤异倍体CTEC
血管内皮细胞 (EC) 构成了正常脉管系统的内膜，而肿瘤脉管内膜主要由“肿瘤血管内皮细胞” (Tumor Endothelial Cell, TEC) 构成。EC与TEC均表达CD31 (血小板及内皮细胞粘附分子-1，PECAM-1)，但不表达CD45 (蛋白酪氨酸磷酸酶C型受体，PTPRC)。TEC可由肿瘤细胞在体内或体外缺氧条件下通过转分化形成，或由肿瘤细胞-内皮细胞融合而来，是细胞表面表达了CD31的一类特殊肿瘤细胞。EC、TEC脱落入血后分别形成循环EC (CEC)、循环TEC (CTEC)。其中，CTEC兼具了肿瘤、内皮的双重特性，被形象地比喻为四处游走的“披着羊皮的狼”[6]。不同亚类的TEC或CTEC分别参与肿瘤血管生成、肿瘤转移、调节免疫监视及患者预后等[6, 7]。
以往人们通常使用CEC评估贝伐单抗疗效，但血液中含有大量与肿瘤并不相干的正常二倍体CEC，因此不同实验室发表的数据差异极大，甚至相互矛盾。本文作者在排除正常CEC干扰的基础上，利用Cox回归模型分析异倍体CTC、CTEC各亚类细胞中的独立风险因素并进行风险评估，以指导后续围绕这些细胞型高风险变量开展相关生存分析，从而揭示CTC、CTEC各亚类细胞在贝伐单抗治疗肺癌过程中各不相同的重要临床意义。
6-通道SE-i·FISH 联合检测上皮、间质及混合型异倍体CTCs 、CTECs
应用SE-i·FISH可有效检测出CTC、CTEC各种亚类细胞。瀑布图分析显示，肺癌CD31- CTC倍体及大小多样，其中3倍体小细胞 (SCTCstri, 20.6%) 及多倍体大细胞 (LCTCsmulti, 42.9%) 为主要代表，而在CD31 CTEC中，多倍体大细胞 (LCTECsmulti, 73.3%) 占据多数。
治疗后CTC、CTEC总数变化与患者PFS、OS密切相关
如 (A) 所示，与治疗前基线相比，患者治疗后CTC和CTEC数目呈现同步上升或下降。泳图 (B)展示了每个患者的疾病进展情况，与CTC、CTEC数目下降组相比, 上升组伴有不良预后，显示较短的mPFS 及mOS。
治疗过程中CTC、CTEC亚类细胞动态变化分析
作者对上升组与下降组的CTC及CTEC各种亚类细胞在治疗过程中的动态变化做了进一步深入分析。热表 (heattable, A) 显示了不同采血点时上皮及间质型CTC、CTEC数量与比例的动态变化，其中N型裸细胞在数量上占据多数。上皮型CTC 及CTEC亚类细胞数目在治疗过程中的动态变化与相应细胞总数变化一致。间质型CTEC 无论在上升组或是下降组均表现为先上升后下降的变化，该现象在局部晚期乳腺癌患者接受新辅助化疗时也有相同报道[8]，其临床意义有待进一步深入研究。图C显示了 CTC及CTEC个亚类细胞的组成比例。
桑基分析：CTC、CTEC各亚类细胞在治疗前后的转换及预后
与CTC形成过程中的EMT相同，不同型别的CTEC亦可通过EndoMT进行相互转换。作者使用新颖的桑基分析，对CTC和CTEC亚类患者分组、相互转换等方面进行了系统性分析，揭示了治疗前及治疗后出现不同亚类细胞的患者的对应衍生关系 (箭头所示)，以及相应的预后情况。
上升及下降组患者的CTC及CTEC在治疗前的基线阶段分别存在3种亚类，其中在CTC的3种亚类细胞 (M, N, E/M) 中，以裸细胞N型为主，而CTEC的各个亚类 (M, N, E) 较为平均。治疗后，如患者出现新的上皮型CTC亚类细胞及混合型 (E/M) CTEC亚类细胞 (红色标注)，则预后较差 (mPFS<9.4 mo)。桑基分析为在治疗前合理选择适于接受贝伐单抗治疗的肿瘤患者及有效预测疗效提供了重要的分析手段与参考依据。
CTC、CTEC亚类细胞与肿瘤进展显著相关
定量分析显示，治疗前含有间质型CTEC及治疗后出现上皮型CTEC或CTC 的患者，治疗效果差，肿瘤进展快 (mPFS=5.0~5.6 mo)。其中，治疗后出现混合型 (E /M ) CTEC的患者疗效最差， mPFS最短 (mPFS=3.0 mo)，而治疗前或治疗后带有裸细胞N型CTEC 的患者则显示治疗效果较好，肿瘤进展较慢 (mPFS=18.3 mo)。该发现对进一步有效开展抗血管生成治疗肿瘤具有重要的参考价值。
结论与展望
异倍体CTEC和CTC，两者相辅相成、功能各异，共同构成了血液中一对“细胞型循环肿瘤标志物”。继本文作者在以前的工作中揭示了间质型 CTC和CTEC与肺癌不良预后及肝转移密切相关[9]，以及PD-L1 CTEC和CTC 在肺癌免疫治疗过程中的重要意义后[10]，本研究进一步证实，相对于CTC，检测多重功能的异倍体CTEC亚类细胞在肿瘤治疗过程中 (包括精准用药指导、疗效预测与评估等) 具有特殊重要的临床意义。
国内外的新近研究显示，与TKI单药相比，贝伐单抗和针对NSCLC不同基因突变的TKI联合用药 (A T) 效果更好，患者具有显著的PFS和OS 获益。例如针对EGFR-T790M抑制性突变的第三代靶向药奥希替尼(osimertinib)/泰瑞沙[11], 针对EGFR-L858R 激活性突变的厄洛替尼(erlotinib)/特罗凯[1, 12] 或吉非替尼(gefitinib)/易瑞沙[13]。此外，anti-PD1 或anti-PD-L1免疫治疗与贝伐单抗 (A I) 联合治疗肺癌也在I-III期临床实验中取得了相对任一单药更好的疗效[14, 15]。随着PD-L1 CTEC和CTC在肺癌O药免疫治疗的临床意义被报道[10]，加上今后对这些A T或A I联合用药治疗的肿瘤患者深入开展CTC与CTEC的检测与研究，将有助于临床更精准、有效地选择适于治疗的患者，并进一步提高肿瘤治疗疗效及揭示疗效增强的机理。
原文下载：http://www.cytointelligen.com/zlwz，第63篇文献
参考文献
1. Zhou et al. (2021) Bevacizumab plus erlotinib in Chinese patients with untreated, EGFR-mutated, advanced NSCLC (ARTEMIS-CTONG1509): A multicenter phase 3 study. Cancer Cell in press. DOI: 10.1016/j.ccell.2021.07.005.
2. Zhang et al. (2021) Role of aneuploid circulating tumor cells and CD31( ) circulating tumor endothelial cells in predicting and monitoring anti-angiogenic therapy efficacy in advanced NSCLC. Mol Oncol in press. DOI: 10.1002/1878-0261.13092.
3. De Sousa Abreu et al. (2009) Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst 5:1512.
4. Vogel et al. (2012) Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet 13:227.
5. Guo et al. (2008) How is mRNA expression predictive for protein expression? A correlation study on human circulating monocytes. Acta Biochim Biophys Sin 2008, 40:426.
6. Lin (2020) Aneuploid Circulating Tumor-Derived Endothelial Cell (CTEC): A Novel Versatile Player in Tumor Neovascularization and Cancer Metastasis. Cells 9:1539.
7. Goveia et al. (2020) An Integrated Gene Expression Landscape Profiling Approach to Identify Lung Tumor Endothelial Cell Heterogeneity and Angiogenic Candidates. Cancer Cell 37:21.
8. Ma et al. (2020) Dynamic monitoring of CD45(-)/CD31( )/DAPI( ) circulating endothelial cells aneuploid for chromosome 8 during neoadjuvant chemotherapy in locally advanced breast cancer. Ther Adv Med Oncol 12:1758835920918470.
9. Wang et al. (2019) Vimentin expression in circulating tumor cells (CTCs) associated with liver metastases predicts poor progression-free survival in patients with advanced lung cancer. J Cancer Res Clin Oncol 145:2911.
10. Zhang et al. (2020) PD-L1( ) aneuploid circulating tumor endothelial cells (CTECs) exhibit resistance to the checkpoint blockade immunotherapy in advanced NSCLC patients. Cancer Lett 469:355.
11. Yu et al. (2020) Effect of Osimertinib and Bevacizumab on Progression-Free Survival for Patients With Metastatic EGFR-Mutant Lung Cancers: A Phase 1/2 Single-Group Open-Label Trial. JAMA Oncol 6:1048.
12. Saito et al. (2019) Erlotinib plus bevacizumab versus erlotinib alone in patients with EGFR-positive advanced non-squamous non-small-cell lung cancer (NEJ026): interim analysis of an open-label, randomised, multicentre, phase 3 trial. Lancet Oncol 20:625.
13. Ichihara et al. (2015) Phase II trial of gefitinib in combination with bevacizumab as first-line therapy for advanced non-small cell lung cancer with activating EGFR gene mutations: the Okayama Lung Cancer Studu Group Trial 1001. J Thorac Oncol 10:486.
14. Chen et al. (2018) Combinations of bevacizumab with cancer immunotherapy. Cancer J 24:193.
15. Manegold et al. (2017) The Potential of Combined Immunotherapy and Antiangiogenesis for the Synergistic Treatment of Advanced NSCLC. J Thorac Oncol 12:194.