RKO细胞基因敲除构建原理及应用

RKO 细胞中DIP2C 的缺失在研究人类癌症中的作用

Disco-Interacting Protein 2 Homolog C （DIP2C），是一种在人体组织和成人肿瘤中高水平表达的非特征基因，在外显子组范围内的激素突变分析中被确定为推定的癌症基因。为了研究DIP2C失活在人类癌症中的作用并确定受该基因活性影响的过程，Larsson等人利用CRISPR/Cas9技术构建了人类DIP2C敲除RKO细胞系。结果显示，RKO 细胞中DIP2C 的敲除会导致细胞增大和生长迟缓。并且Larsson等人揭示了表达水平会受到DIP2C缺失影响的780 个基因，包括编码CDKN2A基因的肿瘤抑制基因、编码上皮间充质转化(EMT)调节因子的ZEB₁以及编码乳腺癌干细胞的CD₄₄和CD₂₄等等。DNA 甲基化分析显示超过30,000个基因位点受差异甲基化影响，其中大部分在DIP2C缺失后发生低甲基化。，而启动子区域 DNA 甲基化的变化与基因表达的变化密切相关。DIP2C敲除后的RKO细胞具有更高的创伤闭合容量，所以DIP2C的缺失将会触发癌细胞中大量的DNA甲基化和基因表达变化、细胞衰老和上皮-间质转化^[1]。

图   DIP2C的缺失导致基因表达的改变

筛选最具耐药性的因子，推进抑制剂的研发进程

坏死的细胞死亡途径是人类病原体防御的一个关键组成部分，在组织稳态过程中可以被异常抑制，从而导致多种类型的组织损伤和疾病。虽然含有RIPK1、RIPK3和MLKL的坏死体激酶信号复合物的形成机制已被熟知，但其调控和效应功能的其他机制仍然有待发现。Callow等人通过CRISPR/Cas9进行了全基因敲除筛选了19,883个小鼠蛋白编码基因，并且通过大规模转导 RKO 细胞获得的 sgRNA 参考文库，筛选出对细胞坏死具有耐药性的因子，然后鉴定了112个坏死调控因子和介质，包括59个新的候选通路成分，发现在没有坏死诱导的情况下细胞生长基本不会受到任何影响。他们还进一步表明了一些组织特异性或应激反应途径可能会通过调节RIPK1来防止受调控的细胞死亡。上述研究结果表明，对RIPK1功能的进一步探索对于推进了新的治疗干预策略或临床抑制剂的开发
^[3]具有重要作用。

图 耐药性因子筛选

全基因组敲除后的RKO 细胞对于放疗CRC提供了至关重要的帮助

结直肠癌 (CRC) 在最常诊断的癌症中排名前三，并且是全球癌症相关死亡的主要原因之一。除了手术切除和化疗，放疗的佐剂也起着关键作用，可以延长患者的生存率。然而在放疗过程中约有50%的患者会对放疗佐剂产生耐药性，从而导致疗效不理想、复发和转移。因此，确定放射抗性的潜在机制，可以改善结直肠癌患者的治疗结果。Yu等人通过在RKO结直肠癌细胞系进行基因组规模的CRISPR 敲除筛选，并结合 NGS 测序，以探索涉及结直肠癌放射抗性的调节因素，最终得到了3个候选基因。他们发现microRNA-5197-5p（miR-5197）可以显著增强IR对RKO的细胞毒性。Yu等人通过进一步的机制研究，证明了miR-5197 直接靶向 CDK6 并抑制其在 RKO 细胞中的表达，可以诱导细胞周期停滞在 G1/S 期并抑制细胞分裂，因此，miR-5197 增强了放射敏感性。研究结果表明，miR-5197 可能是调节 CRC 细胞放射敏感性的关键因素，并为开发对 IR 具有抗性的 CRC 患者的治疗策略提供了帮助^[4]。

图 通过全基因组 CRISPR 敲除筛选鉴定与 CRC 放射抗性相关的候选基因