器官特异性胆固醇代谢异常促进结直肠癌肝转移
❀ 研究背景 ❀
转移性疾病仍然是癌症相关死亡的主要原因。转移是一个复杂的多步骤过程，涉及原发性肿瘤细胞的播散和血管内浸润、循环中播散性肿瘤细胞（DTC）的存活、DTC在远处转移器官中的定植，以及随后这些集落增殖为临床可检测的转移病灶，由细胞内和细胞间信号转导级联的复杂网络调节。器官向性是癌症转移的一个重要特征，许多癌症表现出对特定器官的转移偏好。尽管“种子和土壤”理论已经提出了100多年，但DTC适应和定植新器官环境（转移过程的关键步骤）的机制在很大程度上尚未确定。
代谢改变是癌细胞的特征之一。已知癌细胞会经历许多代谢改变以维持更快的增殖。除了在原发性肿瘤中的作用外，代谢重编程对转移过程也至关重要。最近的研究表明，DTC在转移器官微环境中经历代谢适应，这越来越被认为是癌症转移的关键步骤。DTC的代谢变化在许多实体瘤中也表现出转移器官特异性，支持DTC在不同转移器官中的存活和定植。
结直肠癌（CRC）是全世界最常见的恶性肿瘤之一。大约50%的CRC患者在肿瘤进展期间会发生肝转移。然而，只有一小部分转移性结直肠癌患者有资格接受手术治疗，其他有效的治疗方式也有限，而且这些转移性结直肠癌的治疗方法并没有专门针对肝转移，这使得肝转移成为结直肠癌患者死亡的主要原因。新证据表明，转移性结直肠癌细胞在肝脏发生适应性改变，这对转移性结直肠癌细胞的定植和生长至关重要。然而，转移性结直肠癌细胞的代谢改变在很大程度上仍不确定。
据报道，转移性结直肠癌细胞在肝脏中获得肝脏特异性基因转录程序。肝脏是胆固醇稳态的中心器官，人体大约一半的从头合成胆固醇发生在肝脏。胆固醇是哺乳动物细胞膜的重要组成部分，也是胆汁酸和类固醇激素的前体。乙酰辅酶A从头合成胆固醇在肿瘤生长和进展中起着重要作用。胆固醇生物合成由胆固醇生物合成中的关键转录因子甾醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）及其下游基因控制，包括3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶（HMGCR）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合酶1（HMGCS）和角鲨烯合酶（SS）。大肠癌的DTC是否经历胆固醇代谢改变以适应肝脏微环境尚不清楚。
❀ 技术路线 ❀
❀ 研究结果 ❀
通过定量逆转录PCR（qRT）分析了17对原发肿瘤（PT）和相应肝转移（LM）的CRC样本中胆固醇代谢关键基因的表达。我们发现LM中参与胆固醇生物合成的关键基因，包括SREBP2及其下游靶基因HMGCS和HMGCR的mRNA水平显着高于配对PT中的mRNA水平（图1A）。SREBP2的下游靶基因，负责胆固醇流入（LDLR和SRB1），胆固醇酯合成（ACAT1/ACAT2），胆汁酸合成(CYP7A1/CYP27A1)的 mRNA 水平，在 LM 中也显着上调（图 1B-E）。LM 中的总胆固醇和游离胆固醇水平均显着高于 PT（图1F）。这些结果表明胆固醇生物合成途径在 CRC 肝转移中被激活（图1G）。
图1
为了确定胆固醇生物合成途径的激活是否特异性地发生在 CRC 的肝转移中，我们通过免疫组织化学进一步检测了 CRC 的 PT 及其配对的 LM、脑转移（BM）或淋巴结转移（LNM）中的 SREBP2 蛋白水平,LMs 中 SREBP2 的蛋白质水平远高于PTs（图1H）。而 SREBP2 蛋白水平与其配对的PT相比,在 BM 中（图1I) 或在 LNM （图1J）没有显着变化，表明胆固醇生物合成途径的激活对肝转移具有特异性。
为了进一步验证结直肠癌肝转移的这些发现，我们将HT29细胞(结直肠癌细胞系)同时植入小鼠肝脏和盲肠。结直肠癌肿瘤形成于肝脏和盲肠，我们在注射后四周采集了相应的肿瘤(图2A-B)。qRT-PCR分析证实，来自肝脏的CRC肿瘤中SREBP2、HMGCR和HMGCS mRNA的水平比来自盲肠的增加(图2C-E)。来自肝脏的结直肠癌肿瘤的总胆固醇水平也高于来自盲肠的总胆固醇水平(图2F)。然后我们利用盲肠原位异种移植模型，也可以观察到肝转移组织中SREBP2、HMGCR和HMGCS基因表达的升高以及总胆固醇水平的升高(图2G-L)。以上结果表明，SREBP2依赖性胆固醇生物合成途径在结直肠癌肝转移中被特异性激活。
图2
CRC细胞生长需要胆固醇生物合成途径
接下来，为了确定SREBP2在结直肠癌细胞系体外增殖中的功能作用，我们产生了三个SREBP2特异性短发夹(sh)RNA来抑制SREBP2的表达(shSREBP2)。shSREBP2-2和shSREBP2-3在高表达SREBP2的HT29和SW620细胞中诱导了最显著的敲除效应(图3A和图S3)，并在以下研究中用于敲除SREBP2的表达。SREBP2的敲除通过其下游靶基因HMGCR和HMGCS mRNA水平的降低得到进一步验证(图3B-C)。SREBP2的敲除导致HT29(图3D)和SW620细胞的体外细胞增殖的显著抑制(图3E)。在SREBP2敲除的HT29和SW620细胞中也可以观察到菌落形成的显著减少(图3F-H)。
图3
然后我们测量了细胞胆固醇水平，发现敲除SREBP2导致HT29和SW620细胞中总胆固醇水平明显降低(图3I-J)。我们进一步验证了SREBP2敲除是否引起细胞生长抑制是由于其通过补充SREBP2敲除细胞中的胆固醇而影响细胞胆固醇水平。结果表明，胆固醇补充阻碍了SREBP2敲除抑制HT29和SW620细胞生长的效果(图3K-1)。我们进一步证实了SREBP2依赖性胆固醇生物合成在体内肿瘤生长中的作用。这些体外和体内结果表明，依赖SREBP2的胆固醇生物合成是结直肠癌生长所必需的。
图3
转移性CRC细胞的肝脏定植需要胆固醇生物合成途径
为了研究SREBP2依赖性胆固醇生物合成途径在结直肠癌肝转移中的作用，我们首先通过直接肝内注射建立了实验性结直肠癌肝转移模型(图4A)。来源于HT29 shSREBP2细胞的异种移植肝脏肿瘤比来源于HT29 shNT细胞的要小得多(图4B-C)。为了进一步探索依赖于SREBP2的胆固醇生物合成在转移性结直肠癌细胞在肝脏定植中的作用，我们利用了另一个实验性结直肠癌肝转移模型，即使用BALB/c裸鼠脾内注射用非靶shRNA对照(shNT)或HT29 SREBP2敲除细胞转染的HT29细胞(图4D)。6周后处死小鼠，取出肝脏以评估肝转移。与shNT组相比，shSREBP2组的肝转移灶数量和大小均显著减少(图4E-H)。此外，IHC染色显示SREBP2的敲除在肝转移中得以维持(图4I)。这些结果表明敲除SREBP2可以显著抑制结直肠癌肝转移的体内定植和生长。
图4
HGF通过激活c-Met/mTOR通路诱导CRC肝转移中胆固醇生物合成通路
HGF处理后显著增加了SREBP2在HT29细胞中的表达(图5A-H)。在HGF的治疗下，c-Met、AKT和mTOR的磷酸化水平均显著升高(图5I)。随后，使用mTOR抑制剂雷帕霉素，阻碍了HGF治疗增加磷酸化mTOR和SREBP2表达的效果(图5J)，表明HGF通过c-Met/PI3K/AKT/mTOR轴上调SREBP2表达。为了进一步探索肝脏环境中HGF的来源，我们进行了肿瘤细胞和肝脏微环境中细胞的共培养实验，包括肝实质细胞系L02细胞和人肝星状细胞系LX2细胞(图5K)。我们发现，只有当HT29细胞与L02细胞共培养时，SREBP2及其靶基因HMGCR的表达才显著增加(图5L)。而当HT29细胞与LX2细胞(图5M)或非肝细胞293T(图5N)共培养时，没有观察到显著变化。此外，当与L02细胞共培养时，HGF抗体处理阻碍了HT29细胞中SREBP2和HMGCR基因的表达增加(图5O)。
综上所述，这些结果支持了肝脏微环境中的HGF通过激活肝转移结直肠癌细胞中的c-Met/PI3K/AKT/mTOR轴诱导胆固醇生物合成途径的观点。
图5
靶向胆固醇生物合成途径抑制结直肠癌肝转移
图6
在我们的研究中，我们表明SREBP2依赖性胆固醇生物合成途径的激活在肝转移中被特异性观察到，但在脑转移和淋巴结转移中没有，这表明转移性结直肠癌细胞获得了肝特异性胆固醇代谢特征。之前有几篇文献报道，SREBP2的表达在包括乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌在内的几种癌症中升高并促进癌症进展。然而尚未确定SREBP2在这些癌症的转移中是否升高。
有趣的是，临床研究表明，转移性前列腺癌的血清总胆固醇水平高于非转移性前列腺癌，血清高密度脂蛋白胆固醇水平高与胆囊癌的远处转移有关。Chen等人报道，通过将胆固醇截留在循环黑色素瘤细胞的溶酶体中来靶向胆固醇转运，可以抑制黑色素瘤转移。这些研究表明胆固醇代谢改变在癌症转移中起作用。除了结直肠癌，肝脏也是其他癌症的转移器官，包括胰腺癌、胃癌、乳腺癌、胆囊腺癌和食管鳞状细胞癌。因此，确定SREBP2依赖的胆固醇代谢改变是否也存在于这些癌症的肝转移将是有趣的。
除了从头生物合成，细胞还可以通过肝脏中的LDLR和SRB1摄取胆固醇。与原发组织相比，我们确实观察到肝转移瘤中LDLR和SRB1的表达升高。然而，LDLR和SRB1在结直肠癌肝转移中的表达远低于匹配的邻近正常肝组织，这表明从头生物合成可能是结直肠癌肝转移的主要胆固醇来源。因此，靶向这些器官特异性代谢途径可能是未来治疗癌症转移的一个方向。
我们的发现表明，结直肠癌细胞转移到肝脏时也会发生胆固醇代谢变化，这是肝转移瘤生长所必需的。有趣的是，我们还观察到一些参与其他代谢途径的分化基因，如参与甘油三酯代谢的MGAT1和LIPE。这些代谢变化在结直肠癌肝转移中的作用需要进一步研究。
越来越多的证据表明，与原发肿瘤相比，转移性肿瘤经常表现出改变的代谢模式。然而，这些代谢改变是由原发肿瘤细胞特定亚群的选择引起的，还是由肿瘤细胞对转移器官微环境的适应引起的，仍然是一个悬而未决的问题。在我们的研究中，我们发现来自肝脏微环境的HGF 负责激活 CRC 肝转移中胆固醇生物合成途径，这支持肿瘤细胞对转移器官局部条件进行动态代谢适应的模型。
总之，我们的研究表明，CRC 肝转移特异性胆固醇代谢途径涉及 SREBP2 依赖性胆固醇生物合成的激活，是为了转移性 CRC 细胞在肝脏中的定植而建立的。抑制这种胆固醇生物合成途径可抑制 CRC 肝转移。来自肝脏环境的 HGF 通过激活 c-Met/PI3K/AKT/mTOR 轴上调 CRC 细胞中的 SREBP2。总的来说，靶向胆固醇生物合成途径可能是结直肠癌肝转移的一种有前景的治疗方法。
优点：
1. 通过体内外实验证明了胆固醇合成通路在CRC肝转移中发挥关键作用，并具有器官特异性；
2. 探究了胆固醇通路上调的具体分子机制，为临床肝转移治疗提供了一种潜在的治疗方法。
局限性：
体内实验只用了单个细胞系，用多种细胞系可能更具有说服力。
❀ 参考文献 ❀
“于道各努力，
千里自同风。”
——周行己《送友人东归》