疫苗用mRNA递送系统性能的决定因素
mRNA递送系统性能的决定因素是多因素且相互作用的，包括：(1)它们递送到适当细胞并有效释放mRNA到细胞质翻译机制的效力或能力；(2)它们的佐剂性，可增强免疫应答；和(3)将注射部位过度炎症或全身分布和脱靶表达可能引起的不良事件或毒性的任何作用降至最低。
1、剂量
目前SARS-CoV-2临床试验正在追求的大范围剂量(1-100µg)最容易理解mRNA递送系统的效力（表1）。人体试验中的剂量明确分为核苷修饰RNA(Moderna，BioNTech)较高的30-100µg剂量、未修饰RNA(CureVac，Translate Bio)较低的7.5-20µg剂量，甚至自我扩增RNA（Arcturus，伦敦帝国理工学院）较低的1-10µg剂量。在确定这些剂量时，考虑两个因素：中和抗体滴度水平和与恢复期血浆相比达到的T细胞应答，以及每个剂量下发生的不良事件的频率和严重程度。似乎存在一个相当窄的接受窗口，其中达到保护作用所需的剂量也接近于产生不可接受的频率和严重程度的不良事件的剂量，即所有i期临床试验中试验停药的最高剂量。与恢复期血浆相比，在BioNTech 1期试验中检测的两种改良核苷构建体具有较高的中和滴度，其中编码膜结合全长刺突蛋白的较大构建体具有较低的不良事件频率和严重程度，因此选择其用于3期研究。值得注意的是，剂量以质量表示，而摩尔剂量取决于结构的长度，此外，实际翻译的mRNA量是其中的一小部分，取决于递送系统的效率和靶向特性。
在感染性疾病的预防性mRNA疫苗的动物研究中，当使用鱼精蛋白、树状大分子和早期阳离子脂质系统时，在小鼠体内的10-80µg范围内初始剂量能够产生相当高的中和抗体或免受病毒攻击的保护能力（表3）。当使用最近的LNPs时，当给予两次时，小鼠中和所需的剂量显著降低到接近1µg水平，而对于未修饰的mRNA，剂量似乎较低，接近0.25µg。自我扩增mRNA的剂量可以更低，如0.1µg给药两次或2µg给药一次。在较大的动物模型（仓鼠、雪貂和非人灵长类动物）中，有限的研究表明其剂量范围较宽，为5µg至200µg，无明显模式。有趣的是，当使用体表面积将人用剂量转换为动物剂量时，60 kg人的100µg剂量相当于3 kg恒河猴的15µg剂量和20 g小鼠的0.4µg剂量[139]，大概范围列于表1和表3中。递送系统显然在确定有效剂量中起重要作用。人们强烈希望提高给药效率，以降低剂量并维持效价，因为这有可能通过减少mRNA和给药溶剂的局部反应和脱靶效应来降低不良事件频率和严重程度。减少剂量还将降低所需原料的量和与每个个体接种相关的成本。特别是，目前的COVID-19大流行使人们关注mRNA LNP疫苗的一些重大供应链和生产能力限制，可以用更高效的递送系统来改善。
表3体内预防性接种中的mRNA剂量。显示了不同mRNA递送系统和不同种属诱导中和抗体滴度所需的mRNA剂量，或提供病毒攻毒保护的剂量。与早期递送系统相比，用于mRNA递送的脂质纳米颗粒(LNPs)的出现将所需剂量降低了约10倍。
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输送系统 |
mRNA类型 |
种属 |
剂量 |
读出作用 |
参考文献 |
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裸mRNA |
未修饰 |
小鼠 |
80 µg 两次 |
保护 |
[140] |
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裸mRNA |
自放大 |
小鼠 |
1.25 µg两次 |
保护 |
[140] |
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鱼精蛋白 |
未修饰 |
小鼠 |
10 µg 两次 |
中和滴度 |
[66] |
|
鱼精蛋白 |
未修饰 |
小鼠 |
80 µg两次 |
保护 |
[66] |
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改良Dendrimer |
未修饰 |
小鼠 |
40 µg 一次 或4 µg两次 |
中和滴度 |
[126] |
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DOTAP/DOPE/PEG |
核苷修饰 |
小鼠 |
12 µg两次鼻内 |
中和滴度和保护作用 |
[130] |
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阳离子纳米乳 |
自放大 |
小鼠 |
15 µg 两次 |
中和滴度 |
[70] |
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纳米结构脂质载体 |
自放大 |
小鼠 |
0.1 µg 一次 |
中和滴度 |
[71] |
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LNP (Acuitas) |
未修饰 |
小鼠 |
0.5 µg 两次 |
中和滴度 |
[69] |
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LNP (MC3) |
核苷修饰 |
小鼠 |
10 µg 一次 or 2 µg 两次 |
保护 |
[99] |
|
LNP (MC3) |
核苷修饰 |
小鼠 |
0.4 µg 一次 |
保护 |
[97] |
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LNP (Acuitas) |
核苷修饰 |
小鼠 |
0.5 µg 一次 |
保护 |
[141] |
|
LNP (Acuitas) |
核苷修饰 |
小鼠 |
1 µg 两次 |
中和滴度 |
[49] |
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LNP (Moderna) |
核苷修饰 |
小鼠 |
1 µg 两次 |
中和滴度和保护作用 |
[45] |
|
LNP (Acuitas) |
未修饰 |
小鼠 |
0.25 µg 两次 |
中和滴度 |
[53] |
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LNP (Translate Bio) |
未修饰 |
小鼠 |
0.2 µg 两次 |
中和滴度 |
[56] |
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LNP (Arcturus) |
自放大 |
小鼠 |
2 µg 一次 |
中和滴度和保护作用 |
[58] |
|
LNP (Acuitas) |
自放大 |
小鼠 |
0.1 µg 两次 |
中和滴度 |
[60] |
|
LNP (Acuitas) |
未修饰 |
叙利亚仓鼠 |
10 µg 两次 |
保护 |
[53] |
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LNP (MC3) |
核苷修饰 |
雪貂 |
50 µg 一次 |
中和滴度 |
[97] |
|
阳离子纳米乳 |
自放大 |
非人灵长类动物 |
75 µg两次 |
中和滴度 |
[70] |
|
LNP (MC3) |
核苷修饰 |
非人灵长类动物 |
200 µg 两次 |
中和滴度 |
[97] |
|
LNP (MC3 or Moderna Lipid H) |
核苷修饰 |
非人灵长类动物 |
5 µg 两次 |
中和滴度 |
[42] |
|
LNP (Acuitas) |
核苷修饰 |
非人灵长类动物 |
30 µg两次 |
中和滴度 |
[49] |
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LNP (Moderna) |
核苷修饰 |
非人灵长类动物 |
100 µg 两次 |
中和滴度 |
[45] |
|
LNP (Translate Bio) |
未修饰 |
非人灵长类动物 |
15 µg两次 |
中和滴度 |
[56] |
2、效力和递送效率
有许多研究试图确定LNP和其他核酸递送系统的结构-功能关系。LNP最常被引用的决定其效力或递送效率的特征是其pKa。pKa是LNP中50%可电离脂质质子化的pH值。迄今为止，LNP pKa仅用称为TNS的染料结合测定法测量，TNS带负电荷，结合带正电荷的LNP后出现荧光增强[88]。在覆盖广泛pH值范围的缓冲液中与TNS孵育的LNPs的荧光测量用于推断染料与表面电荷的结合，当出现最大荧光的一半时，即得到pKa估计值。众所周知，基于MC3的Onpattro LNP在IV给药后沉默肝细胞的最佳pKa为6.4[92]。对于任何能够影响肝细胞沉默的LNP，其TNS pKa在6.2-6.8范围内都有一个非常尖锐的最佳值。解释这种pKa依赖性的极好模型是基于LNP中的可电离脂质在pH 7.4时接近中性，而内化进入细胞后，内涵体pH明显下降，随着内涵体途径吞噬的推进，从而逐渐质子化可电离脂质，然后，它将与内涵体的阴离子内源性磷脂结合，并破坏其双层结构，将mRNA释放到细胞质中进行核糖体装载[17]。内涵体破坏需要可电离脂质的额外特征，即脂质尾部横截面大于其头基的锥形形态。这使得可电离的脂质/内涵体磷脂离子对与双层不相容，更可能形成可破坏内体膜的倒六角形相等结构。这被称为分子形状假说[91]，解释了为什么在饱和C18烷基链中引入一个或两个双键会产生更多的圆锥形和更少的圆柱形形态，即膜破坏和溶酶体溶解[88]。这两个C18亚油酸尾，结合二甲胺头基的适当调整pKa，是MC3可电离脂质的明确特征。替代MC3进行mRNA递送的可电离脂质保留了pKa的需求，但通过在烷基尾部引入更多的分支来追求更大的内体溶解特性。例如，Moderna的脂质H和脂质5具有三个烷基尾，Arcturus的脂质2,2(8,8)4 C CH3也是如此，而Acuitas ALC-0315具有四个烷基尾，A9具有五个烷基尾（表2）。这种增强的锥形形态可能是为什么包含这些可电离脂质的LNPs是更有效的递送载体，具有更大的内体释放的原因。
尽管LNP pKa和分子形状假说被公认为有助于LNP递送效率，但其他因素也很重要，如PEG–脂质在LNP表面的稳定性，以及乙醇溶液中4种脂质的比例，最终决定了LNP超微结构。如上所述，PEG–脂质通过提供亲水性外壳控制LNP大小，限制组装过程中的囊泡融合，使较高的PEG–脂质浓度产生较小的LNPs。例如，一项研究表明，PEG脂质的摩尔分数从0.25%变为5%可使LNP大小从117 nm减小至25 nm，肝细胞沉默的最佳大小为78 nm，由2.5%PEG脂质生成[142]。由于PEG–脂质的烷基尾有14个碳，它没有稳定地锚定在LNP表面，被发现在循环中从LNP逐渐脱落，同时可电离脂质MC3和DSPC的脱落。这种PEG脱落被认为在某个时间点使LNP有转染能力，但是，如果太极端，导致可电离脂质和DSPC的快速丢失，这将对内体释放产生负面影响。例如，通过将烷基尾延伸到18个碳，PEG–脂质没有脱落，但在肝细胞中也没有沉默。另一方面，加入较高浓度的PEG使颗粒变小，导致更快的脱落，可电离脂质的损失和沉默减少。LNP的不稳定和动态性质目前只是部分了解。另一项研究还发现，与100 nm处的较大LNP（0.5%PEG-脂质）以及48 nm处的较小LNP（3%PEG-脂质）相比，用1.5%PEG-脂质制成的中等大小直径64 nm的LNP对mRNA递送更有效，与上述研究相似[89]。然而，通过改变四种脂质的摩尔比，在64 nm 1.5%PEG–脂质LNP中发现的最佳值下保留LNP PEG层下DSPC的计算密度，这些研究者能够制造更大的100 nm LNPs，与64 nm大小的LNPs相比，mRNA表达增加两倍。因此，除了LNP pKa、可电离脂质分子形状和PEG–脂质的动力学外，LNP超微结构的更详细特征和各组分的状态在确定效价方面也很重要。
另详细研究了siRNA-LNPs的内体释放细胞摄取和内体运输，并假定与mRNA LNPs的摄取和内体运输相似。对于MC3 LNP，在电子显微镜下使用胶体金颗粒计数进行的定量研究表明，只有2%的内体siRNA实际上从内体逃逸到细胞质中，导致每个细胞有几千个siRNA分子可用于沉默[106]。然而，这个数字与在治疗相关浓度下每个细胞与RISC相互作用的功能活性siRNA的估计水平在相同的范围内。因此，绝大多数siRNA注定会发生内体降解或通过多泡体（晚期内体）再循环，在外泌体中释放[143,144]。增加LNPs的内体溶解行为是提高递送效率的中心方法，主要是通过pKa调整LNP和通过增加可电离脂质的锥形形态。对于后者，Lipid H[42]和Lipid 5[101]，在MC3中含有三个分支而在MC3中含有两个分支，但具有相似的pKa，与MC3相比，内体释放增加了4倍。Acuitas ALC-0315的内体释放尚未见报道；但其肝细胞沉默效率是MC3的10倍[47]，提示其更多的锥形四分支结构也具有更高的内体释放。因此，这些新一代的可电离脂质似乎实现了内体释放，与MC3 siRNA-LNPs发现的2-5%相比，接近15%或更高。这方面的挑战之一是缺乏一种可靠的标准化内体释放方法，可以广泛实施。已经开发了许多方法，但通常仅针对一个实验室组[42,101,145,146,147,148,149]。最近还发现mRNA发生胞吐作用的量与释放到细胞质中的量相似[150]。MC3 LNPs在晚期内体和MC3的NP 1复合物中解体，mRNA被重新包装成从细胞中输出的外泌体。这些内-外泌体保持了与它们来源的原始MC3 LNPs相似的mRNA递送能力，但可以运输到不同的组织，似乎免疫激活较少。LNPs递送的mRNA的这种外泌体再分布的潜在意义仍有待探索。
4、电荷和配体介导的靶向作用
早期的脂质纳米颗粒使用永久带电不可电离且很大的阳离子脂质，由于它们的永久正电荷，被迅速调理，一般靶向肺。BioNTech的研究小组减少了DOTMA/DOPE mRNA LNPs中阳离子DOTMA的量，直到NP比率小于1时，阴离子mRNA过量导致净电荷为负电荷。静脉注射这些带负电荷的300 nm大的mRNA LNPs后，产生脾脏靶向作用，树突状细胞中的mRNA表达，它们能够介导肿瘤免疫治疗的适应性以及I型IFN介导的先天性免疫机制[151]。同样，使用C12-200原型LNP产生脾脏靶向mRNA LNPs，但用小的树突可电离脂质Cf-Deg-Lin替换C12-200，它具有4个亚油酸烷基链和4个氮原子，TNS pKa为5.7。LNP的这种非常低的pKa将确保可电离脂质在pH低于7时才被质子化，这种LNP可以承担mRNA的净负电荷，可一直维持到细胞内体途径吞噬，因此类似地运输到脾脏[152]。他们发现脾脏中表达mRNA的主要细胞群是B淋巴细胞，根据流式细胞分析，其中7%的B淋巴细胞表达mRNA。最近，使用三种不同的碱性LNPs实现了电荷介导的靶向作用，MC3、C12-200或5A2-SC8作为可电离脂质混合在永久性阳离子脂质(DOTAP)或永久性阴离子脂质(18 Pa)的一定摩尔分数中，赋予LNPs净正性，净负电荷或中间近中性净电荷[153]。与上述发现一致，高阳性LNPs靶向肺部，高阴性LNPs靶向脾脏，而中间电荷水平主要靶向肝脏。已证明肝脏靶向作用依赖于Apo-E与近中性脂质体或LNPs的结合[154]，而带负电荷的脂质体不会发生这种情况[155]。
脂质纳米颗粒具有自身的佐剂活性。一项在小鼠（10µg剂量）和非人灵长类动物（100µg剂量）中进行的核苷修饰mRNA LNPs（来自Acuitas）（编码各种免疫原）研究显示，与灭活病毒相比，抗原特异性滤泡辅助性T细胞(Tfh)和生发中心B细胞(GC B)的数量增加[33]。Tfh细胞驱动免疫球蛋白类别转换、亲和力成熟以及长期B细胞记忆和浆细胞。当FLuc mRNA LNP与蛋白亚单位HA免疫原共同给药时，发现了LNP本身的佐剂特性，生发中心B细胞数量增加了4倍，尽管与单独蛋白相比，Tfh细胞的数量没有增加。因此，LNP似乎放大了GC B细胞的反应，特别是对核苷修饰的mRNA LNP。另一项研究使用来自默克的不对称可电离脂质研究了LNPs作为乙型肝炎蛋白亚单位疫苗的佐剂[163]。LNPs与蛋白亚单位疫苗共同给药增强了B细胞对与已知疫苗佐剂相当水平的反应，包括基于铝的佐剂、寡核苷酸和TLR4激动剂、3-O-脱酰基单磷酰脂质a(MPL)。LNPs引起了强效的抗原特异性CD4 和CD8 T细胞应答，Th1与Th2偏倚可能进一步受到LNP中包含额外佐剂的影响。该组使用登革病毒免疫原进行的后续研究发现，LNP中的佐剂活性同样较强，且该活性取决于是否存在可电离脂质[164]。脂质体中的脂质组分之前也被认为在粘膜疫苗中具有佐剂活性[165,166]。
6、mRNA LNPs的注射部位反应、安全性、耐受性、反应原性
在大鼠和非人灵长类动物中，对表达hEPO的MC3核苷修饰的mRNA LNPs进行静脉注射给药的一般安全性研究发现，剂量高达0.3 mg/kg时出现轻度毒理学事件，该剂量是预期治疗剂量的10倍以上[167]。大鼠中的主要结果为白细胞计数增加、所有剂量下的凝血参数变化以及肝损伤。非人灵长类动物显示淋巴细胞耗竭伴轻度和可逆的补体激活。这些结果与相同LNPs用于siRNA递送的早期毒理学研究一致[168]，其中在6 mg/kg时观察到大鼠死亡，而无可见有害作用水平(NOAEL)确定为1 mg/kg。观察到血清生化参数（ALT、AST和TBIL）升高3 mg/kg以上、血尿以及肝脏（空泡形成、炎性细胞浸润、纤维化、出血和肝细胞坏死）、脾脏（淋巴萎缩和坏死）和肾脏（肾小管变性/再生）的镜检结果。患者中的安全性结果包括输注相关反应（15%的患者，推测为补体介导）和促炎性细胞因子一过性升高。值得注意的是，上述IV给药剂量（如0.3 mg/kg）比当前使用IM给药的SARS-CoV-2临床试验高10倍以上。尽管如此，当前人体试验中的这些较低剂量仍可诱导局部注射部位反应和全身不良事件的高频率和有时中度严重程度。目前，关于这些动物中人类不良事件的相关性，发表的动物研究很少。
使用MC3 LNP进行广泛的恒河猴研究，观察注射部位和mRNA表达的转运，以50µg剂量肌内或皮内注射核苷修饰的mRNA（编码流感免疫原H10 mRNA）[98]。他们发现4-24h内注射部位的细胞快速浸润，可由LNP单独驱动，主要由中性粒细胞和单核细胞组成。表达mRNA的主要细胞类型为注射部位和引流淋巴结中的多个单核细胞和树突状细胞亚群。T细胞应答的启动仅限于引流淋巴结，LNP单独不能诱导抗原呈递细胞的CD80。疫苗特异性CD4 T细胞的持续生成仅发生在疫苗引流淋巴结中，其中mRNA编码抗原的检测在24h达到峰值，而抗体应答持续数周。使用编码狂犬病病毒糖蛋白G(RABV-G)的非修饰mRNA，以Acuitas LNP递送小鼠0.5-10µG剂量以及非人灵长类动物10µG和100µG剂量，也报告了与上述一致的结果[69]。他们还发现，LNP单独介导了肌肉注射部位和引流淋巴结中的细胞因子生成，但需要认识到由于通过血液的运输和在肝脏中的表达， 可以在系统中检测到IL6。在10µg和100µg剂量下，在非人灵长类动物中均观察到注射部位红斑和水肿。
值得注意的是，mRNA递送系统中使用的LNPs的尺寸范围为10-100 nm，已知是淋巴管摄取的最佳尺寸，脂质聚乙二醇化可改善淋巴管中的滞留[169]，并可减少补体激活[109]。自辉瑞/BioNTech疫苗的紧急使用批准以来，已观察到数例急性过敏反应，相当于每100,000次疫苗接种中1例，约为其他疫苗的10倍[170]。这种过敏反应的一个可能来源是抗PEG抗体在一般人群中的流行，由于在LNPs中使用PEG–脂质，这可能在患者亚组中触发过敏反应。已经观察到PEG介导的过敏反应，例如，在临床造影剂[171]和多柔比星脂质体制剂[172]中。尽管如此，当前SARS-CoV-2疫苗的给药剂量对应于PEG总剂量，比这些产品中发现的剂量低至少15倍，这似乎减少了这种可能性。另一种可能是反应本质上是过敏样反应，但是对炎症和其他因素的非特异性反应。目前正在进行一项临床研究，以进一步阐明该问题[173]。
在过去的二十年里，mRNA疗法的进展是非凡的，从使用改良核苷和序列工程来确定控制mRNA先天免疫原性的手段，以及mRNA在疫苗和其他治疗适应症中的应用开始。与以前的系统相比，采用siRNA递送中使用的脂质纳米颗粒原型导致递送效率提高了一个数量级，并在不断改进，主要是由于设计了新类别的可电离脂质。mRNA LNP结构、功能、效力、靶向性和生物学特征的许多方面如佐剂性等，仍有待探索，以便充分开发这种强大和变革性治疗方式的潜力。
原文来源：Automated Manufacture of Autologous CD19 CAR-T Cells for Treatment of Non-hodgkin Lymphoma.Front.Immunol.11:1941. DOI:10.3389/fimmu.2020.0194