Tunel法应用、实验步骤及注意事项

Tunel是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

　　Tunel法详细的实验步骤

　　1. 常规方法制作石蜡切片，用二甲苯浸洗2次，每次5min;

　　2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3min;

　　3. PBS漂洗2次;用Proteinase K工作液(20ug/ml)处理组织15-30 min 在21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;

　　4. 加入含2%过氧化氢的PBS，室温反应5min，PBS漂洗2次

　　5. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。

　　6. 玻片干后，用滤纸小心吸去切片周围多余液体，加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。

　　7. 加入到已预热37℃的洗涤与终止反应缓冲液，37℃保温30min，PBS漂洗3次;

　　8. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm);

　　9. 玻片干后加50μl DIG-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。

　　10. PBS漂洗3次;在组织处加50~100μlDAB底物，反应15~25℃×10min;

　　11. PBS漂洗3次;拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

　　12. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落;而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体)

　　注意事项

　　(1) 出现非特异性荧光标记：组织或细胞未充分固定;使用了不适当的固定液; TUNEL反应时间过长，或反应液渗漏。

　　(2) 荧光背景高：支原体污染片;细胞核中的DNA断裂;TUNEL反应过强;红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。

　　(3) 标记效率低：使用甲醇或乙醇固定;固定时间过长;未避光操作。