CRISPR/Cas9技术背景及原理

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats）规律成簇间隔短回文重复；Cas9（CRISPRassociated nuclease）是CRISPR相关核酸酶，CCRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导的，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。

CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物基因中，是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这些生物体中，来自噬菌体的外源遗传物质获得和整合入CRISPR位点。这些序列特异的片段被转录成短CRISPR的RNA（CRISPR-derivedRNA），crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，然后tracrRNA/crRNA复合体指导Cas9蛋白切断双链DNA。

一旦crRNA结合到Cas9，Cas9核酸酶的构象发生改变，产生一条能通道，让DNA更容易结合。Cas9/crRNA复合体能够识别PAM(5'-NGG)位点导致DNA解旋，使crRNA找到PAM位点相邻的DNA互补链。当Cas9结合到PAM位点相邻的，与crRNA互补的DNA序列上，REC叶内部的桥螺旋和靶DNA形成RNA-DNA 异源双链结构。PAM位点的识别包括可使靶DNA双链断裂(DSB)的HNH和RuvC核断裂的激活，导致DNA降解。如果crRNA与靶DNA不互补，Cas9将会释放出来，寻找新的PAM位点。DNA中的线性靶基因组断裂后可以通过非同源末端接合(NHEJ)或者同源介导的修复(HDR)来进行修复，而非同源末端接合(NHEJ)会引起插入或者删除错误，从而达到定点敲除某种基因的目的。

在利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA（sgRNA）表达同样可以起到靶向剪切的作用。因此现在我们用的CRISPR/Cas9工具只有Cas9核酸酶和gRNA两部分。应用此工具，我们可以非常方便快捷的进行任意基因的编辑改造，比如基因敲除，敲入，定点突变等等。CRISPR/Cas9机制可用于包括哺乳动物细胞在内的各种系统的基因工程中,如下图所示。

CRISPR/Cas9的成功与否的关键问题在于gRNA的设计，gRNA和非目标区域过多的非特异性结果，脱靶效率较高，特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性。目前为了提高基因组编辑的准确性，对Cas9核酸酶进行了突变，突变后的Cas9只能切割DNA双链中的一条链，通过两个gRNA引导Cas9对DNA切割，可以显著提高基因组编辑的特异性，降低脱靶效应。