论文：LncRNA-encoded polypeptide ASRPS inhibits triple-negative breast cancer angiogenesis（INcRNA编码多肽ASRPS抑制三阴性乳腺癌血管生成）

摘要

三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一种亚型，具有最具侵袭性的表型和较差的整体生存率。利用生物信息学工具，我们发现LINC 00908编码60-AA多肽，在TNBC组织中差异表达.我们将此内源性表达多肽ASRPS(STAT 3的小调节肽)命名为ASRPS。

ASRPS在TNBCs中的表达下调，与患者整体生存能力差有关。我们展示了LINC 00908是由ERα直接调控的，它负责对LINC 00908在跨国公司。ASRPS通过螺旋线圈结构域(CCD)与STAT 3直接结合，下调STAT 3磷酸化，导致VEGF表达降低。

在人内皮细胞、小鼠异种移植乳腺癌模型和小鼠自发BC模型中，ASRPS的表达降低了血管生成。在小鼠异种移植乳腺癌模型中，ASRPS的下调促进了肿瘤的生长，ASRPS是一种抗肿瘤肽。我们提供了强有力的证据LINC 00908编码多肽ASRPS代表TNBC特异性治疗靶点。

TNBC特异性鉴定LINC 00908

为了鉴定TNBC特有的INcRNAs，我们首先使用以下标准搜索具有编码能力的INcRNA：(1)ORFFinder编码ORF；(2)ORF与GWIPS数据库中核糖体谱数据的峰重叠。共鉴定出583个INcRNAs。

然后，我们寻找与正常组织(SET A)相比在TNBC组织中差异表达的INcRNA，而在非TNBC组织中与正常组织(SET B)差异表达的INcRNAs。共鉴定出26个候选的incRNAs。

然后，我们用定量RT-PCR(qRT-PCR)技术检测了这26种incRNAs在53对TNBC和邻近正常组织中的表达，其中18例表达差异。在这18个incRNAs中，只有10个在53对非TNBC和正常组织中没有差异表达。

最后，对mda-MB-231和Hs578T细胞进行了多体分析和qPCR分析，其中只有4株检测到了mdma-mB-231和hs578T细胞。利用ORFFinder，预测了这4种INcRNAs中所有在(+)意义上具有起始ATG密码子的大于30 aa‘s的推测ORF。

并在C端标记的pcDNA3.1中构建。将质粒转染到tnbc细胞株mda-mbb-231中，westernblot分析表明：LINC 00908-ORF 3翻译成多肽。

为了确定ASRPS是否内源性表达，我们对MDA-MB-231细胞进行了多体分析.将mRNA-蛋白质颗粒(MRNPs)分为三个组分：非核糖体(不含任何核糖体的mRNPs)、40~80年代(与核糖体相关但未被翻译的mRNPs)和多态体(mRNPs正在积极翻译)。

用qRT-PCR法测定各组分中ASRPS RNA的含量。结果表明，ASRPS RNA在MDA-MB-231细胞的多态组分中富集.用Cy3标记的原位杂交探针LINC 00908和一种fITC标记的抗asrps抗体，我们同时检测了这两种抗体。

LINC 00908和ASRPS在同一个肿瘤中或邻近正常组织，两者在相邻正常组织中均有高表达。此外，我们还制备了抗ASRPS的兔多克隆抗体，同时检测到ASRPS-GFP和ASRPS-标志融合蛋白。

什么时候LINC 00908用shRNA沉默MDA-MB-231和Hs578T细胞。ASRPS抗体检测到的ASRPS含量显著降低，进一步证实了ASRPS抗体的特异性。

的差异表达的潜在机制LINC 00908在TNBC中，我们构建了荧光素酶报告子(pGL 3-)。LINC 00908)使用启动子区域LINC 00908(C1-C4。由于与非tnbc细胞相比，errα在tnbc细胞中被下调，我们检验了errα可以直接调控的假设。

LINC 00908转录。我们展示了LINC 00908ER显著降低−BC组织与ER的比较+TCGA数据库中的BC组织。此外，我们还发现在ERα中，asrps多肽有明显的下调作用。−BC肿瘤组织。

接下来，我们在非tnbc细胞系中敲除ERα，在tnbc细胞系中过高表达ERα。荧光素酶分析表明，非tnbc细胞ERα基因敲除后，其转录水平明显降低。LINC 00908，而ERα过表达增加了LINC 00908在TNBC细胞系。用westernblot方法检测ASRPS的表达水平。

我们的临床资料表明，ASRPS在TNBC中的表达下调，与肿瘤生长增加和OS低下有关。为了阐明ASRPS的作用机制，我们发现ASRPS与STAT 3直接结合。

所有STAT蛋白都有相似的结构，包括6个保守结构域：N端结构域，然后是CCD结构域，DNA结合域，连接体结构域，SH2结构域和C端反活化结构域。

我们的数据表明，STAT 3的CCD对于与ASRPS的相互作用是必不可少的。以前的研究表明，STAT 3的ccd对自磷酸化是必不可少的。某些蛋白质通过与STAT 3 CCD结构域结合而抑制STAT 3的激活。

甚至K 116，一种STAT 3变构抑制剂，也通过与STAT 3的CCD结合，抑制了Tyr 705的STAT 3磷酸化。通过分子对接，我们发现在CCD区域的ASRPS结合区与K 116结合区重叠。

这表明ASRPS也可能通过与STAT 3 CCD结构域结合而影响STAT 3磷酸化。此外，我们还发现，ASRPS与STAT 3的结合抑制了STAT 3的磷酸化，但也抑制了IL-6诱导的STAT 3的活化。

这与目前对STAT 3 ccd结构域的认识是一致的：它不仅是通过sh2结构域介导的受体结合和IL-6诱导激活其所必需的，而且也是通过磷酸化激活它的关键。

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