ISME：南农张瑞福组揭示芽孢杆菌通过代谢互作刺激常驻根际微生物促进植物生长！
Bacillus velezensis通过代谢互作刺激根际常驻Pseudomonas stutzeri促进植物健康生长
Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions
The ISME Journal [IF: 10.302]
DOI：https://doi.org/10.1038/s41396-021-01125-3
发表日期：2021-09-30
第一作者: Xinli Sun(孙新丽)1,2, Zhihui Xu(徐志辉)1
通讯作者：Ruifu Zhang(张瑞福)(rfzhang@njau.edu.cn)1, Zhihui Xu(徐志辉)(xzh2068@njau.edu.cn)1,6
合作作者: Jiyu Xie(解继驭),Viktor Hesselberg-Thomsen, Taimeng Tan(谈泰猛), Daoyue Zheng(郑道越), Mikael L. Strube, Anna Dragoš, Qirong Shen(沈其荣), Ákos T. Kovács
主要单位：
1南京农业大学(Jiangsu Provincial Key Lab of Solid Organic Waste Utilization, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Solid Organic Wastes, Educational Ministry Engineering Center of Resource-Saving Fertilizers, The Key Laboratory of Plant Immunity, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu, People’s Republic of China)
2丹麦科技大学(Bacterial Interactions and Evolution Group, DTU Bioengineering, Technical University of Denmark, Kongens Lyngby, Denmark)
作者新闻稿
各类植物益生芽孢杆菌是主要的微生物肥料生产菌种，其在单菌层面上的植物促生机制已有较深入的研究，主要包含活化根际养分、分泌促生活性物质和诱导植物系统抗性等。然而，植物益生芽孢杆菌对根际土著微生物的影响，以及这些改变是否对宿主植物有益，尚不清楚。
近日，微生物生态学领域著名期刊The ISME Journal正式刊出了南京农业大学土壤微生物与有机肥团队张瑞福课题组的最新研究成果，“Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions”。该研究发现施用典型根际益生芽孢杆菌SQR9**不仅可以独自促进植物生长，其代谢产物还能诱导土著“帮手”微生物—施式假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的显著富集，并与菌株SQR9共同在植物根际形成稳定的混菌生物膜。合成菌群的代谢建模、代谢组学分析以及功能基因敲除实验证明菌株SQR9能与土著施式假单胞菌代谢互养(Cross-feeding)，拓宽了双菌菌群在植物根际的生态位宽度，并且这种代谢依赖驱动两株植物益生菌的长期共存，协同增强植物益生能力。
基于以上理论，研究人员开发了以芽孢杆菌和假单胞菌为基础的合成菌群微生物肥料产品，盆栽实验证实该产品能显著促进植物生长并协助植物耐盐，效果显著优于单菌施用。基于本研究结果申请了微生物肥料产品专利。本研究实现了从理论探索到产品开发的完整闭环，为设计更高效的生物肥料菌群产品提供了理论指导。
摘要
营养互作在推动微生物群落组装和功能方面发挥着核心作用。在肠道或土壤生态系统中，有效的定殖总是有助于成功接种；本研究，我们运用生物信息学、遗传学、转录组学和代谢组学分析来揭示黄瓜根际接种剂(Bacillus velezensis SQR9)和对植物有益的土著Pseudomonas stutzeri之间的互养合作。我们发现这两个物种的协同相互作用高度依赖于环境，互养合作的出现仅在静态营养丰富的生态位中很明显，例如除根际外的生物膜。我们的结果确定支链氨基酸 (BCAAs) 生物合成途径参与共养合作。基因组水平的代谢建模和代谢分析也证明了细菌菌株之间的代谢促进作用。此外，来自芽孢杆菌的生物膜基质成分对于相互作用至关重要。重要的是，这两个物种联盟促进了植物生长并帮助植物缓解了盐分胁迫。总之，我们提出了一种机制，其中生防细菌和搭档细菌之间的协同互作促进了植物健康。
主要结果
图1 B. velezensis SQR9 对根际微生物组、生物膜表型和具有预测协同作用的分离细菌定量的影响
a 基于物种分类数据Bray−Curtis距离矩阵的根际细菌群落的主坐标分析 (PCoA)。使用'vegan’包中的 adonis 函数在R中进行置换多变量方差分析 (PERMANOVA)。从未经处理的对照 (CTL) 和 经B. velezensis SQR9(SQR9)接种植物 (n = 6) 的根际分离出的样品。
b 对照(CTL)和B. velezensis SQR9(SQR9)接种处理的 根际样品之间属水平相对丰度的绝对差异(Welch’s t 检验；P < 0.05)。与Pseudomonas spp.相匹配的
ASVs被标记为红色。误差线代表标准偏差。c 预测合作菌株的生物膜表型。XL271-278 代表不同的Pseudomonas分离株。平板为 15.6 mm。
d 膜生物量按鲜重和干重定量。SQR9 代表 B. velezensis SQR9，XL271-278 代表不同的Pseudomonas spp。绿色条形代表 B. velezensis SQR9 单一培养。共培养是指与菌株 SQR9 共培养。膜在TSB培养基中培养24 h。被提供的数据是平均值±标准差(n = 4−6)。使用两因素方差分析进行显著性检验，然后通过 Prism 8 进行 Tukey 事后检验。不同的字母表示统计学上具有显著差异(p < 0.05)。
图2 P. stutzeri XL272 和 B. velezensis SQR9 在某些条件下协同形成生物膜
a 通过鲜重和结晶紫测定法定量生物膜生物量。在静态 TSB 培养基中培养生物膜。P代表P. stutzeri XL272单独培养膜，S代表B. velezensis SQR9单独培养膜，PS代表共培养膜。条形代表平均值±sd(n = 6)。不同的字母表示根据 ANOVA、通过 Prism 8 进行的 Tukey 检验的统计存在显著差异 (p < 0.05)。
b 互作强度被定义为共培养中 DNA 拷贝数相对于单一培养中平均 DNA 拷贝数的对数尺度。相互作用强度 > 1 表示促进，而 < 1 表示抑制。条形代表平均值±标准差(n = 6)。静态 TSB 和静态 REM(根分泌物培养基)代表结构化、营养丰富的条件，摇动的 TSB 代表非结构化、营养丰富的条件，静态 MSgg 代表结构化、营养有限的条件。合作只发生在结构化、营养丰富的条件下。
c TSB 培养基中单一培养和共培养的生物膜形成。在 CLSM 下观察由 P. stutzeri XL272(洋红色)和 B. velezensis SQR9(绿色)形成的生物膜。
d 在 TSB 琼脂上生长的菌落。DsRed 标记的 P. stutzeri XL272 为洋红色，GFP 标记的 B. velezensis SQR9 为绿色。
图3 胞外基质 EPS 和 TasA 在富含 TSB 的培养基中对共生至关重要
a 胞外多糖 EPS (ΔepsD) 和 TasA 蛋白纤维 (ΔtasA) 生物合成缺陷的突变体形成薄膜生物膜。在拍摄图像之前，将细胞在 TSB 中于 30 °C 下孵育 24 小时。平板直径为 15.6 mm。
b 两物种生物膜中的细胞数。圆点代表 B. velezensis，三角形代表 P. stutzeri。提供的数据是平均值±标准差 (n = 6)。
图4 P. stutzeri XL272 和 B. velezensis SQR9 在两物种 TSB 生物膜中的转录反应和突变体验证
a 响应于 TSB 共培养的被诱导(右侧条形)和抑制(左侧条形)的基因的 KEGG 通路分析。LFC > 2、FDR < 0.05的通路受到显著调节并以红色显示。
b 通过 qRT-PCR 检验的支链氨基酸生物合成途径中涉及到的基因的相对倍数的变化。颜色表示与单独培养相比，共培养中 mRNA 的平均相对倍数变化 (n = 6)。
c 突变体形成生物膜。在拍摄图像之前，将细胞置于 TSB 或 MSgg 中于 30 °C 下孵育 24 小时。
d TSB 培养基中两物种生物膜的细胞数。
e MSgg 培养基中双物种生物膜的细胞数。圆点代表 B. velezensis，三角形代表 P. stutzeri。颜色表示共培养中的 B. velezensis 菌株基因型：WT(粉红色)、∆ilvA(棕色)、∆ilvCH(绿色)、∆ilvD(蓝色)、∆leuBCD(洋红色)。P. stutzeri XL272 促进了 B. velezensis SQR9 ∆ilvD 和 ∆leuBCD 在营养有限条件下的生长。被提供的数据是平均值±标准差。(n = 6)。
图5 代谢促进和趋化吸引稳定合作
a 在纯 TSB 培养基中培养的单一培养(方形)、在补充有 10% 其他物种上清液的 TSB 上培养的单一培养(圆形)和共培养(六边形)的生长曲线。B. velezensis SQR9 TSB 用过的培养基促进了 P. stutzeri XL272 的生长。“K”表示生长能力，“R”表示生长率，由growthcurver R包计算。
b M9 消耗培养基实验的示意图。分离物在 M9 葡萄糖培养基中独立生长 6 天(B. velezensis SQR9)或 4 天(P. stutzeri XL272)，直到检测到葡萄糖，然后从悬浮液中滤出细胞。滤液用作另一种分离株的生长培养基。两种分离物都能够在彼此分离物的代谢副产物上生长。
c 图 (B) 中细胞培养第 4 天的 OD600 吸光度。
d 图 (B) 中细胞培养第 4 天通过 CFU 测定量化的活细胞数。
e 消耗培养基实验的代谢曲线。S 表示在 M9 葡萄糖上生长的 B. velezensis 用过的培养基，S_P 表示在 B. velezensis 的无细胞滤液上生长的 P. stutzeri 用过的培养基，P 表示在 M9 葡萄糖上生长的 P. stutzeri 用过的培养基，P_S 表示 在 P. stutzeri 的无细胞滤液上生长的 B. velezensis 用过的培养基。品红色圆圈符号表示 P. stutzeri 可以在含有这些化合物的 M9 培养基上生长，绿色圆圈符号表示 B. velezensis 可以在含有这些化合物的 M9 培养基上生长。品红色方形符号表示 P. stutzeri 对这些化合物表现出趋化反应。
图6 植物根部的共定殖
a 拟南芥根分别被 B. velezensis SQR9(GFP，着色绿色)、P. stutzeri XL272(DsRed，假色洋红色)和混合物定殖，使用 CLSM 进行可视化。比例尺代表 20 µm。
b 菌落定植能力以每毫米根的CFU计(n = 6)。24 h 收集样品。将单一定殖的定殖能力与共定殖进行比较。根据通过 R 进行的未配对学生 t 检验，星号表示具有统计学意义(p < 0.01)。
图7 该组合菌群促进植物生长并缓解盐胁迫
a 照片显示了在接种了 S (B. velezensis SQR9)、P (P. stutzeri XL272) 或 PS(P 和 S 的混合物)的普通水稻土或盐处理水稻土中生长的 6 周龄黄瓜植株。CTL 代表在普通土壤中生长而没有接种细菌的植物。
b 植物的茎高。
c 植株茎干重量。
d 植物叶片叶绿素含量。条形代表平均值±标准差(n = 10−12)。使用两因素方差分析进行显著性检验，然后通过 Prism 8 进行 Tukey 事后检验。不同的字母表示具有统计学上差异显著 (p < 0.05)。
图8 原理示意图
a 应用PGPR B. velezensis SQR9后根际发生的时序事件模型；
b 基于基因组水平代谢模型的 B. velezensis SQR9 和 P. stutzeri XL272 之间的互养；
c 基于体外实验的 B. velezensis SQR9 和 P. stutzeri XL272 之间的互养。
本研究由国家自然科学基金、国家重点研发计划和国家留学基金委等项目的资助，我校资源与环境科学学院博士生孙新丽和徐志辉副教授为论文共同第一作者，徐志辉副教授和张瑞福教授为共同通讯作者。沈其荣教授，丹麦科技大学Ákos T. Kovács教授、Anna Dragoš副教授等均参与了该项研究。张瑞福课题组近年来围绕生物肥料功能菌株芽孢杆菌SQR9的植物益生机制，在根际定殖与成膜机制、促生物质挖掘、诱导植物系统抗性和拮抗土传病原菌机制等方面取得了一系列成果。相关工作在Cell Reports、Environmental Microbiology、Applied and Environmental Microbiology、Molecular Plant-Microbe Interactions和Journal of Proteomic Research等国际权威期刊发表。
作者简介
孙新丽：南京农业大学直博生，目前在丹麦进行为期两年的国家公派留学学习交流(CSC)。
徐志辉：南京农业大学副教授，研究领域：根际微生物学、肥料学。研究方向：1、根际微生物生物膜形成与根际定殖分子机制；2、根际微生物互作机制与调控；3、根际稳定型复合菌剂开发与应用。目前正参与国家重点研发计划子课题两个，主持国家自然科学基金面上项目一项。
张瑞福：教授、研究员，南京农业大学获理学博士，先后在香港大学、美国德克萨斯农工大学、加州大学戴维斯分校从事博士后研究。2010年4月起作为南京农业大学高层次引进人才任南京农业大学资源与环境科学学院教授，博士生导师。2013年入选教育部新世纪优秀人才，2015年1月破格晋升为三级教授，兼任中国农科院农业资源与农业区划研究所微生物资源与利用研究室研究员，博士生导师，创新团队首席科学家，国家菌种资源库常务副主任，中国农业微生物菌种保藏管理中心主任，农业部农业微生物资源收集保藏重点实验室主任。主要从事根际微生物与生物肥料、农业有机废弃物微生物降解转化与有机肥料研究。发表SCI论文80多篇。曾获得中国科协优秀科技论文奖、中国自然资源学会青年科技奖、教育部科技进步一等奖、国家科技进步二等奖、农业部中华农业科技奖优秀创新团队奖、大北农科技奖、教育部技术发明一等奖、国家科技进步二等奖、全国农牧渔业丰收三等奖。兼职SCI 杂志 International Biodeterioration & Biodegradation 编委、SCI 杂志 Journal of Integrative Agriculture 编委、《微生物学杂志》编委、《农业科技导报》编委。
本公众号解读过的张瑞福团队的其他作品
PCE：南农张瑞福组揭示微生物肥料菌种芽孢杆菌应对植物免疫防卫实现根际定殖的新策略
Nature子刊：南农沈其荣、张瑞福团队揭示多样性激发的确定性细菌装配过程限制群落功能
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编译：旭日阳光
责编：马腾飞 南京农业大学
审核：刘永鑫 中科院遗传发育所
Reference
Xinli Sun,Zhihui Xu,Jiyu Xie,Viktor Hesselberg-Thomsen, Taimeng Tan,Daoyue Zheng, Mikael L. Strube, Anna Dragoš, Qirong Shen, Ruifu Zhang, Ákos T. Kovács. Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions. The ISME Journal. (2021). https://doi.org/10.1038/s41396-021-01125-3