灵芝多糖提取工艺及含量测定
芝芪康艾颗粒为兰州市肺科医院感染科的协定方，由黄芪、党参、灵芝、鱼腥草、柴胡、甘草等中药组成，用于治疗心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食等症状［1］。多糖是灵芝的主要有效成分，现代研究证实，灵芝多糖可促进单核巨噬细胞与自然杀伤细胞的功能；促进树突状细胞成熟、分化及抗原提呈功能；活化淋巴细胞、增强T细胞的功能和细胞因子生成［2］。本研究用正交试验法优选灵芝多糖工艺，采用蒽酮－硫酸法［3］对灵芝多糖进行了含量测定，为建立其质量标准提供科学依据。
1 仪器与试剂
FA2004B电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；KH-500DE数控超声波清洗器（功率250W，频率50kHz，昆山禾创超声仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；UV-2450紫外分光光度计（岛津）。蒽酮（购自上海中秦化学试剂有限公司），硫酸纯化水，D-无水葡萄糖对照品（110833-201205）购自中国食品药品鉴定研究院；灵芝提取物（兰州市肺科医院制剂室生产，批号分别为20160325、20160411、20160425）。
单桩嵌岩工艺2的具体流程如图2所示。首先通过单桩自沉如泥、桩锤沉桩，将单桩打至岩层表面；其次，在单桩内部下钻机，扩孔钻至设计底标高处；此后，将钻机提出，在单桩内下放内套管；再次，将内套管和钻孔间灌满混凝土，即灌浆环节；最后，用桩锤继续讲单桩沉桩至指定标高。
2 灵芝多糖的工艺研究和制备
2.1 正交试验设计 以加水倍量（A）、提取时间（B）及提取次数（D）为考察因素，以灵芝多糖提取量为指标，按正交L9（34）进行试验，因素水平、正交试验设计及结果和方差分析分别见表1、表2和表3。
我们牙牙学语时，父母是最耐心的老师，那时并不会想到，父母也会老，他们会老到话都说不清，会因为词不达意大发雷霆，甚至会让人无可奈何……当年老的父母口齿不清时，怎样才能和他们更高质量的交流呢？
2.2 正交试验结果 由方差直观分析，灵芝多糖的极差数据 RA＞RD＞RB，各因素作用主次为 A＞D＞B，其最佳工艺为A1B3D3。综合表3方差分析结果可看出，因素A对灵芝多糖的影响有统计学意义（P＜0.05）；而因素B、D，对灵芝多糖的影响无统计学意义（P＜0.05）。为了缩短生产周期，降低生产成本，得最佳提取条件为A1B1D3，即以12、9、9倍水分别提取三次，每次提取时间40min。
3 灵芝多糖的含量测定
3.1 标准曲线的制备 分别精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml浓度为0.1mg/ml的葡萄糖对照品溶液置于10ml具塞试管中，分别加水至2ml，空白对照加水2ml，依次精密加入硫酸蒽酮溶液6ml，摇匀后置水浴加热15min，取出，放入冷水浴中冷却15min，以相应的试剂为空白，于625nm处测定吸光度，以葡萄糖溶液的浓度作为横坐标，以吸光度 A值为纵坐标，做标准曲线。得到回归方程为Y=41.686X+0.42367（r=0.999），线性范围为 0.005～0.03mg/ml。
表1 因素水平表
水平D提取次数（次）1 2 3 A加水量（倍）22 26 30 B提取时间（min）120 150 180 1 2 3
表2 L9（34）正交试验设计及结果
试验号1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 K1 K2 K3 R A 1 1 1 2 2 2 3 3 3 B 1 2 3 1 2 3 1 2 3 C 1 2 3 2 3 1 3 1 2 D 1 2 3 3 1 2 2 3 1多糖生药含量（mg/g）3.03 2.51 3.24 2.41 1.84 1.99 2.34 2.64 2.72 8.78 6.24 7.70 2.93 2.08 2.57 0.85 7.78 6.99 7.95 2.59 2.33 2.65 0.32 7.66 7.64 7.42 2.55 2.55 2.47 0.07 7.59 6.84 8.29 2.53 2.28 2.76 0.48
表3 表3方差分析结果
方差来源F自由度P A B D误差离差平方和1.083 0.175 0.351 0.012 2 2 2 2均方0.542 0.087 0.175 0.006 91.632 14.799 29.652＜0.05＞0.05＞0.05
3.2 灵芝多糖供试液的制备 不同工艺条件下水提取液浓缩，干燥，得干浸膏，精密称取0.05g，加水定容至100ml。其中多糖生药含量是指：1g灵芝药材里含有的多糖量。即浸膏里多糖的含量×干膏率
3.3 试剂配制 硫酸蒽酮溶液制备方法：称取蒽酮0.1g加入80%硫酸溶液100ml使溶解，摇匀。对照品溶液制备方法：精密称取无水葡萄糖对照品10mg，加水使溶解，定容至100ml，摇匀，制成浓度为0.1mg/ml葡萄糖对照品溶液。
3.4 方法学考察
3.4.1 标准曲线的制备。分别精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml浓度为0.1mg/ml的葡萄糖对照品溶液置于10ml具塞试管中，分别加水到2ml，空白对照加水2ml，依次精密加入硫酸蒽酮溶液6ml，摇匀后置于水浴中加热15min，取出，放入冷水浴中冷却15min，以相应的试剂为空白，在625nm处检测，以葡萄糖浓度作为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程为A=32.543C+0.1949（r=0.999），线性范围为 0.0025～0.0175mg/ml。见图 1。
言语就搁在那儿进行不下去了。冯一余尴尬地蹭了一会儿，又说，其实，其实这也不能算是雇用什么的，其实这也是互相帮助嘛。老人互相看看，没有再搭理他。其中一个说，差不多了，回家煮晚饭了。一个个都站了起来，走了，把冯一余一个人扔在那里。
3.4.2 精密度。精密量取葡萄糖对照品溶液0.4ml置于10ml具塞试管中，按照标准曲线项下自加水至2ml起操作，连续测定6次考察仪器精密度。RSD=0.16%，仪器精密度良好。
我又连着喝了几大碗水，把嗓子里的药片慢慢泡小一点然后咽了下去，这时突然发现药瓶上写着三个大字——咀嚼片！
3.4.3 重复性。称取同一批次灵芝浸膏粉5份，按照2.1项下“样品制备”方法和样品含量测定方法进行操作，考察操作方法的重现性。RSD=1.36%，重复性良好。3.4.4 稳定性。取0.01mg/ml的葡萄糖溶液1.0ml置于10ml具塞试管中，按照标准曲线项下自“加水至2ml”起操作。分别在 0、10、20、30、40、50、60、90、120 和 150分钟处测定吸光度A。见表4。
图1 标准曲线
表4 稳定性实验结果
时间（min）多糖生药含量（mg/g）3.19 010 3.26 20 3.17 30 3.22 40 3.26 50 3.16 60 3.23 90 3.24 120 3.27 150 3.25
3.4.5 加样回收率。取已知含量的同一编号样品粉末约0.025g，精密称定，加入相应量的葡萄糖对照品溶液，依法测定，根据色谱峰峰面积值，计算回收率，得RSD=0.44%。见表5。结果表明，本法回收率好。
3.4.6 样品含量测定。取3批灵芝，按照2.1项下“样品制备”方法制备样品溶液。取2ml样品溶液按照标准曲线项下自“精密加入硫酸蒽酮溶液6ml”起操作，由回归方程计算，即得样品含量。见表6。
从IR谱图可知，在3376cm-1左右出现了弯曲较弱单振动吸收峰，在1395 cm-1处有较窄的吸收峰，可确证分子中存在胺结构；3100～3000cm-1为=C-H的伸缩振动峰；2922cm-1左右为-CH2反对称伸展振动峰，1463cm-1左右为-CH2前剪式振动峰或-CH3反对称振动峰，故可确证有亚甲基结构的存在；在1640cm-1左右出现了C=C基团的强特征峰。
表5 回收率测定结果
组分 加入量（mg/g）平均回收率（%）RSD（%）灵芝多糖样品称重（g）0.0247 0.0249 0.0251 0.025 0.0256 0.0254 0.0255 0.0252 0.0258多糖生药含量（mg/g）3.20 3.22 3.23 3.24 3.30 3.26 3.28 3.25 3.31 2.60 3.2598.320.44 3.90测得量（mg/g）5.72 5.75 5.76 6.37 6.40 6.42 7.01 7.03 7.08 0.718 0.092回收率（%）98.6207 98.7973 98.7993 98.1510 97.7099 98.6175 97.6323 98.3217 98.1969
表6 样品含量测定结果
样品批号20160325 20160411 20160425多糖生药含量（mg/g）3.19 3.25 3.22 RSD（%）0.93
4 讨论
本实验通过正交试验设计考察了灵芝多糖提取的总加水量（22、26、30倍）、总提取时间（120、150、180min）及提取次数（1、2、3），由方差分析得到提取时间对灵芝多糖的影响无统计学意义。为了缩短生产周期，降低生产成本，确定提取时间为120分钟。得到最佳提取条件为A1B1D3，即以12、9、9倍水提取三次，每次40min。
通过紫外-可见分光光度法对灵芝多糖样品在190～800nm之间进行全波长扫描，当吸收波长在625nm时，样品溶液的吸光度最大在用硫酸-蒽酮法测定多糖时，考察了显色温度（30、50、70、80、100℃），显色时间（10、15、20、25、30min），随着显色温度的升高，吸光度值增大，在70℃时吸光度值达到最大；显色时间在15min时，吸光度最大，随着显色时间的延长，吸光度变化不大，所以确定多糖的最佳检测波长为625nm，最佳显色时间为15min。
多糖在自然界来源广泛，毒副作用小，近年来中药多糖研究成为热点，研究证明中药多糖有调节免疫、抗氧化、抗肿瘤和抗病毒等生物活性，对增强机体免疫有广泛影响［4］。硫酸-蒽酮法已广泛运用于多糖含量测定，此方法方便快速、稳定性与重现性良好［5-6］。灵芝含有多糖、三萜和甾醇等多种有效成分，用于抗肿瘤、调节免疫、抗心血管病等多种疾病的治疗［7］。现代研究表明，灵芝多糖有广泛的免疫调节活性，能够提高机体免疫活性，灵芝三萜类化合物还具有抗HIV的作用。本实验采用蒽酮-硫酸法测定了灵芝多糖含量，为灵芝药材质量控制提供科学依据。
参考文献
［1］ 国家药典委员会.中国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2015.
［2］ 林志彬.灵芝抗肿瘤作用的免疫学机制及其临床应用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2015，29（6）：865-882.
［3］ 朱海涛，楚亚琴，陈黎.正交试验优选蒽酮-硫酸法测定白芨多糖含量条件［J］.中国医院药学杂志，2014，34（20）：1714-1718.
［4］ 郭浩杰，杨严格，安乐，等.中药多糖的分子修饰及其药理活性研究进展［J］.中草药，2015，46（7）：1074-1080.
［5］ 张杰，李春艳，李劲平，等.蒽酮硫酸法与苯酚硫酸法测定竹节参多糖含量的比较研究［J］.中南药学，2012，10（6）：421-424.
［6］ 马趣环，石晓峰，王新娣，等.苯酚硫酸法与蒽酮硫酸法测定糙叶败酱多糖含量的比较研究［J］.西部中医药，2015，28（12）：30-33.
［7］ 刘太峰.灵芝的现代研究概述［J］.产业与科技论坛，2012，11（18）：60-62.