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Identifcation of molecular markers associated with the progression and prognosis of endometrial cancer: a bioinformatic study子宫内膜癌中与病程进展和病人预后相关的分子标志物鉴定：生物信息学分析
一、背景介绍
子宫内膜癌（EC）是一种女性中常见的恶性肿瘤，死亡人数近20年成倍增长，一直缺乏有效的诊断和治疗方法。随着高通量测序技术的发展以及公开数据库的增多，通过综合分析各个数据，我们可以更准确的预测肿瘤发展，分析发病机制，为EC治疗提供方向。
二、分析流程
三、结果解读
1.DEGs鉴定与富集分析
作者鉴定了GSE17025与TCGA数据集中的DEGs，在GSE17025数据集中使用 “limma” 包以 p < 0.05，|log2fold change (FC)| ≥ 2为标准；TCGA 数据集中使用 edegr包以 FDR< 0.01 ，|log2fold change (FC)| ≥ 2为标准。TCGA中有1644个高表达，970个低表达基因；GSE17025中有101个高表达，147个低表达基因。然后做出韦恩图判断两数据集的重叠，2a结果显示两个数据集有84个共同高表达基因，2b结果显示两组有70个共同低表达基因。接着，作者对这些基因进行GO与KEGG富集分析，3a,c为GO功能富集分析结果，3b,d为KEGG富集结果，结果显示高表达基因在趋化因子活性，微管结合，趋化因子受体结合，RAGE受体结合，微管运动，微管蛋白结合活动中富集（3a）,在IL-17通路中富集(3b);低表达基因在糖胺聚糖结合和胶原结合活动中富集(3c), 在安非他眯成瘾中富集(3d)。
图2.GSE17025 与TCGA数据分析韦恩图
图3.功能富集分析
2.核心DEGs鉴定与功能分析
作者进一步以p<0.05 ，|logFC|≥2为标准对DEGs进行筛选，找到了154个核心DEGs，同样进行GO与KEGG富集分析。4a-c为GO可视化结果，结果显示在生物过程模块，有丝分裂核分裂过程基因富集最多；在细胞组成模块，细胞外隙基因富集最多；在分子功能模块，微管蛋白结合功能基因富集最多（4a,4b）,作者进一步分析得到了10个显著富集的GO terms与基因间的关系（4c）。KEGG分析结果显示DEGs在IL-17通路，趋化因子信号通路，TNF信号通路中富集（4d）。
图4.核心DEGs富集分析
3.PPI网络与聚类分析
作者从STRING数据集中获得蛋白质间相互作用的信息（PPI），使用Cytoscape可视化结果，获得了PPI网络。5a显示DEGs-PPI网络共包含154个点代表154个DEGs对应的蛋白质,382条边代表蛋白质间相互作用。作者分析了其中30个关键蛋白，做出5b关键蛋白直方图，y轴表示基因名称，x轴表示相连基因数量，柱长表示基因间的连接数量，结果表明NCAPG与其他基因的连接最多。
图5.PPI网络聚类分析
然后作者使用MCODE插件对PPI网络进行聚类分析，将其分为了四个模块，6a-6c分别展示了模块1-3的聚类结果，模块1包含25 个节点和284 个连接(6a), 模块2包含 7 个节点和 21 个连接 ( 6b), 模块3包含8个节点和11个连接（6c), 模块4包含3个节点和3个连接。进一步作者对4个模块进行功能分析，分析各个模块对EC的影响。GO富集分析结果显示模块1 DEGs在微管运动，肌动过程和微管结合中富集（7a）；模块2 DEGs在趋化因子受体结合，CXCR趋化因子受体结合，细胞因子受体结合，G蛋白偶联受体结合，细胞因子受体活性和配体活性中富集(7b) ；模块3 DEGs在内肽酶抑制剂活性，内肽酶调节剂活性，肽酶抑制剂活性，肽酶调节和转录激活活动，RNA聚合酶II启动子近端序列特异性结合过程中富集（7c）。KEGG富集结果显示模块1在细胞周期通路中富集（7d），模块2在趋化因子信号通路与细胞因子受体间相互作用中富集(7e)，模块3在 IL-17信号通路中富集（7f）。
图6.PPI网络模块分析
图7.各模块的GO与KEGG富集分析
4.可能有效的小分子药物
CMap是一种使用计算机模拟药物对生理状态影响的方法，如果得出正相关分数，表明药物会诱导相关生物过程；得出负相关分数，表明药物可以逆转相关生物过程，可能有治疗作用。作者使用CMap对比EC样本与健康组织，筛选出了呈强负相关的药物，8a-8c展示了top3分子药物结构,它们可能对EC治疗有效。
图8.top3分子药物
5.预后标志物鉴定
作者使用单因素CoxPH分析，以p<0.05为标准，筛选出预后相关DEGs, top10为MAL, BCHE, P2RY14, ASPM, CA3, FAM13C, FAM83D, CXorf57, SFN，CPED1，再对它们进行多因素CoxPH分析排除干扰因素影响，最终确定了BCHE, FAM13C, CA3, P2RY14, ASPM,MAL 。按照6个基因表达进行风险评分：
Risk score=0.126BCHE−0.121FAM13C+ 0.136 *CA3− 0.139 * P2RY14+0.231 ASPM+0.0892MAL
根据风险评分，作者将病人划分为高低风险组。9a生存曲线显示高风险组预后明显较差，然后做出5年生存率ROC曲线，AUC=0.751表明预测准确度较高（9b）。9c通过散点图展示了两组病人风险得分，虚线表示两组的分界，红色为高风险组，绿色为低风险组。9d为两组病人生存时间分布，绿色表示存活，红色则为死亡。9e展示了6个基因标志物表达，红色代表高表达，绿色代表低表达。
图9.基于6个核心基因的生存分析
作者使用单因素与多因素CoxPH回归分析了基于6个基因表达水平的风险得分与其他临床指标，结果显示排除其他因素干扰，肿瘤状态与风险得分可以作为独立的EC预后影响因素。
表1.EC病人OS与6个基因表达关系的单因素与多因素分析
6.核心基因验证
作者使用R语言对BCHE, ASPM ,MAL进行突变分析，8a为BCHE突变分析结果，野生型与突变型两组基因表达差异明显，p=0.001有统计学意义。进一步作者对BCHE野生型和突变型病人进行生存分析，8b为两组的生存曲线，结果显示BCHE突变型病人预后更好，说明BCHE突变可能是EC病人的保护因素。
图10.BCHE验证
作者使用UALCAN网站分析MAL和ASPM在肿瘤组织和正常组织中的表达，11a,b结果显示两个基因在肿瘤组织中的表达均高于正常组织。然后作者对高表达或低表达两基因的病人进行生存分析，11c,d为对应的生存曲线，结果显示两基因的高表达组预后均较差，说明MAL和ASPM均与生存时间负相关。作者进一步分析了不同类型，不同分期EC组织中两基因的表达，12a,b结果显示在不同类EC组织中MAL和ASPM的表达均高于正常组织，12c,d结果显示不同分期EC中两基因表达同样高于正常组织，与上文结果一致。之后，作者使用SPSS 23.0进行ROC曲线分析评估MAL和ASPM区分EC组织和正常组织的能力，13a为ASPM结果，13b为MAL结果。
图11.UALCAN网站验证
图12.UALCAN网站验证
图13.使用ROC曲线与AUC评估MAL和ASPM区分EC组织和正常组织的能力
活体组织样本取下后在−80 °C环境保存，作者对其进行免疫组化染色，14a为正常组织染色结果，染色浅，强度弱，占比75 - 25%，区域为胞质/ 胞膜；14b为肿瘤组织染色结果，染色中等深度，强度中等，占比> 75%，区域为胞质/ 胞膜，说明肿瘤组织中ASPM表达比正常组织更高。
图14.ASPM免疫组化染色
作者使用Oncomine 4.5数据集对MAL的DNA拷贝数变异（CNV）进行分析，15A为MAL在TCGA子宫内膜与子宫内膜浆液腺癌数据集中的拷贝数箱线图，15B为MAL在TCGA子宫内膜与子宫内膜混合腺癌数据集中的拷贝数箱线图，15C为MAL在TCGA子宫内膜与子宫内膜样腺癌数据集中的拷贝数箱线图，与正常组织相比，在不同类型EC组织中CNV增高，且排名均在top5%。然后作者在活体组织中使用qRT-PCR分析基因表达水平，15D显示MAL在肿瘤组织的表达量显著高于正常组织。
图15.MAL拷贝数与临床样本验证
7.基因富集分析（GSEA）
为确认MAL与ASPM的潜在功能，作者进行了KEGG通路富集分析。fig.16为ASPM富集分析结果，8个ASPM高表达基因集中“细胞周期”，“ DNA复制”，“卵母细胞减数分裂”，“ p53信号通路”，“胰腺癌”，“孕激素介导的卵母细胞成熟”，“小细胞肺癌”，“泛素介导的蛋白水解 ”通路富集。fig.17为MAL富集分析结果，8个MAL高表达基因集中“ B细胞受体信号传导途径”，“膀胱癌”，“细胞周期”，“慢性粒细胞白血病”，“甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢”，“白细胞跨上皮迁移”，“胰腺癌”，“小细胞肺癌”通路富集。
图16.8个在EC中富集的ASPM 高表达基因集
图17.8个在EC中富集的MAL高表达基因集
小结
作者从GSE17025与TCGA 数据集中鉴定出EC相关DEGs,并对它们进行功能分析，做出的PPI网络图，发现NCAPG是EC中重要的功能蛋白。然后作者通过CMap函数，确定了3种EC治疗药物，分别为噻吩鸟苷，白藜芦醇和曲古抑菌素。最后，通过cox回归分析，经过突变分析，UALCAN网站分析，免疫组化，Oncomine数据验证，确定了3个潜在EC预后标志物：BCHE, MAL, ASPM。