文末惊喜！单基因结合实验验证泛肿瘤分析发5+分的Ebiomedicine
TP63 isoform expression is linked with distinct clinical outcomes in cancer
TP63亚型表达与癌症的不同临床结果有关
一、 研究背景
在多方式的积极治疗下，50%的肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)患者仍将发展为致命的转移复发。因此，识别预后生物标志物，以确定患者的复发和死亡风险是至关重要的。TP63通常在膀胱和其他类型的癌症中表达，但它在肿瘤生物学和预后指标中的作用尚不清楚；它可以表达为多个独特的异构体，根据它们表达的氨基端结构域可分为DNp63和TAp63两类。先前的研究表明，这些不同的TP63亚型在肿瘤生物学和患者预后中具有不同的作用，但TP63亚型的表达尚未系统地描述并与临床结果相关。
二、 分析流程
三、 结果解读
1.泛癌中TP63的表达水平及其与生存的关系
作者从TCGA中29个疾病队列中下载了z-score标准化的RNA-seq数据（8519例），以z-score作为标准化后的数据，得到在泛癌中TP63.表达水平较高的几种癌症类型，其中包括BLCA（图1.a）
利用单因素cox回归分析，发现TP63的高表达与以TCGA-低级别胶质瘤（LGG）、TCGA-皮肤黑色素瘤（SKCM）为代表的的癌症队列的生存率降低显著相关；而与以TCGA-乳腺癌（BRCA）等为代表的癌症队列的生存率提高显著相关 （图1.b）
接下来作者针对TP63表达与BLCA患者预后的关系进行分析，首先对BLCA队列患者进行TP63高/低表达的分组（取最低的10%分位数作为分界），接着对TP63高/低表达分组做kaplan-meier(KM)生存分析，结果显示高表达组BLCA患者的中位OS（44.8mos）明显高于低表达组的中位OS（19.8mos）（图1.c、d）
对BLCA不同分子亚型做cox回归分析，发现TP63表达与腔内分子亚型患者生存率提高有显著相关性；而与基础鳞状亚型患者生存率的相关性不显著，这一结果提示了TP63对预后的差异效应可能与癌症的分子亚型有关（图1.e）
图1.泛癌中的TP63表达水平及其生存分析
2.构建BLCA中TP63亚型的完整列表
在Refgene和Gencode数据库中共有14个TP63亚型，而在BLCA队列的至少7%（28名患者）样本中又鉴定出两个额外的TP63异构体，在这里作者将两种异构体称为DNp63αP和DNp63βP， 为了证实DNp63αP和DNp63βP亚型在人膀胱癌中确实表达，作者构建了一组引物（如图2.c）
图2.b显示利用cufflinks获得的TP63异构体目录，同时也是制作引物（图2.c）的依据
用构建好的引物做qPCR。253J和UM-UC10细胞株的内源性TP63表达较低，作为阴性对照。；DNp63α过表达的UM-UC10细胞株作为阳性对照。只有当DNp63α异构体被过表达时，对应于TP63α的PCR产物才能在UM-UC10中被稳定地检测到。以上结果表明：DNp63αP和DNp63βP两种亚型存在于人膀胱癌细胞中（图2.d）
图2.BLCA中TP63亚型的鉴定过程
3.TP63亚型表达的定量
作者考虑了多个异构体量化算法(Salmon、Kallisto和Cufflinks)后，使用了量化预测结果与TP63亚型的RT-PCR结果最接近的salmon算法，以下是作者对salmon算法准确性的检测。
首先，给出用salmon算法计算出的BLCA队列中的TP63亚型表达水平，以及原发性膀胱癌队列、UMICH膀胱癌细胞系中的TP63亚型表达水平，得出一致的结论：DNp63是膀胱癌中的主要TP63亚型，TAp63的表达相对较少（图3.a、b、c）
对TP63的prime和non-prime型异构体进行RT-PCR，将结果与基于salmon算法的定量结果进行比较，发现结果中都出现了prime亚型高表达，且两种方法得到的表达比例接近（图3.d、e）
对TP63的α、β、δ异构体进行RT-PCR，将结果与基于salmon算法的定量结果进行比较，发现在两种方法得到的结果中α、β、δ异构体的表达比例基本一致（图3.f、g）；由以上两点结果证实了使用salmon算法可以准确的预测TP63亚型的表达
为了在蛋白水平检验TP63亚型的表达水平是否与在mRNA水平上的一致，作者对总TP63和TP63α进行了immunoblot（免疫印迹）。结果显示：DNp63α分别占UM-UC5和UM-UC14细胞系中TP63蛋白表达总量的84%和80%；而基于salmon的定量结果显示，在UM-UC5和UC14中DNp63α的表达对应于TP63mRNA总量的90%和91%。这一结果让DNp63是BLCA中的表达的主要亚型有了说服力（图3.h）
对TCGA泛癌队列绘制TP63亚型表达水平的热图，除个别例外，基本与BLCA中的亚型表达比例一致。（图3.i）
图3.用salmon算法进行TP63亚型定量的准确性验证
4.不同TP63亚型对BLCA不同分子亚型的预后影响分析
TP63亚型在基底鳞状（BS）、腔乳头（LP）、腔浸润、腔和神经内分泌亚型中的表达谱有明显差异：DNp63亚型在LP和BS亚型中的表达明显高于其他亚型(Wilcoxon p<0.0001)；BS亚型患者的TAp63表达明显高于腔内亚型 (Wilcoxon p<0.0001)，这说明 DNp63和TAp63在不同BLCA亚型中有不同的表达谱，且会产生不同的预后影响（图4）
图4.DNp63与TAp63基于BLCA分子亚型的表达差异
将BLCA患者分别按照DNp63表达量（第10%分位数cut-off）和TAp63表达量（第95%分位数cut-off）进行分组，并分别对BLCA、BRCA、TCGA-肺鳞癌（LUSC）做KM生存分析，结果显示DNp63和高表达组和TAp63的低表达组的中位OS明显更高，所以认为DNp63的高表达与患者生存率的提高有关，而TAp63的高表达与患者生存率的降低有关（图5.a、b）
接着作者对DNp63和TAp63两亚型对BLCA分子亚型的具体预后作用做单因素cox分析，发现DNp63与腔内亚型的生存率提高有关（HR=0.89），而与BS亚型预后基本无关；TAp63与BS亚型生存率降低有关（HR=2.35），而与腔内亚型预后基本无关（图5.c）
已知有年龄和病理阶段与BLCA的生存有关，为了验证DNp63和TAp63表达对BLCA预后影响的独立性，作者进行了多因素cox回归分析，结果证明：在控制年龄和病理分期的条件下，DNp63高表达与BLCA预后生存率提高明显有关，TAp63高表达与BLCA生存率降低明显有关，证明了两种亚型对BLCA预后价值的独立性（图5.d）
图5.DNp63和TAp63对BLCA不同分子亚型的具体预后关系
分别用DNp63和TAp63亚型与TCGA泛癌队列做单因素cox回归，将两种TP63亚型表达的预后价值上升到泛癌水平，结果显示，DNp63高表达改善了BRCA、BLCA、LUSC等的癌症预后；而TAp63的高表达则与BLCA、LUSC等癌症的预后恶化有关（图6.a、b）
由于DNp63和TAp63表达与预后的相反关系，作者假设TP63与预后改善或恶化的关联可能要用DNp63和TAp63两种异构体的相对丰度的变化来解释。于是作者分别计算了TAp63和DNp63在TCGA各类癌症人群中相对于TP63的平均比例，并将每种癌症的这一数值与对应癌症HR值相关联作出散点图，结果显示TP63预后较差的疾病具有更高的TAp63水平和更低的DNp63水平（图6.c、d）
图6.DNp63和TAp63在泛癌水平的预后效应
5.DNp63与TAp63的相关信号通路预测
分别做BLCA、BRCA、LUSC人群中高表达DNp63和高表达TAp63的队列的GSEA基因富集分析，（用Wilcoxon-P值来对GSEA的基因集进行排序，并识别统计富集的基因集）。发现DNp63高表达的肿瘤患者有与表皮细胞分化、角化和皮肤发育有关的富集基因集；将同样的方法应用于TAP63，发现了与适应性和天然免疫反应、VEGF通路、Jak- Stat通路和其他几种转录因子(CHOP、PAX6、TCF11、MAFG) 有关的常见富集基因集（图7.a、b）
作者使用来自HPRD数据库（human protein reference database：人类蛋白互作信息数据库http://www.hprd.org/）中的蛋白相互作用数据来识别可能与TAP63相关的候选信号通路。由32个基因构建的通路包含总共40个蛋白质相互作用，包括与免疫反应、细胞应激反应和肌动蛋白细胞骨架组织有关的信号。这些发现意味着TAp63具有作为免疫细胞相互作用的生物标志物的潜力，进一步增强了它的预后价值（图7.c）
图7.DNp63和TAp63亚型的信号通路预测
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