震撼！盘点4D生物打印技术在生物医学中的应用
3D打印技术日趋成熟，已经广泛应用到各种领域。3D打印就是通过电脑控制可以把“打印材料”一层层叠加起来，最终把计算机上的蓝图变成实物。最近，生物打印应运而生，所谓的生物打印就是利用3D打印技术，以生物相容性材料和活细胞为材料，打印出复杂三维功能组织结构。这些打印出来的功能组织和器官，可以应用到多个生物医学领域，比如器官移植、药物筛选等领域。
尽管有这么多好处和应用，但是3D生物打印有一个主要的缺点：它只考虑的打印对象的初始状态，并且假定打印对象是静态的，无生命的。比如，3D生物打印技术是基于这样一个假设前提，印刷细胞通过细胞粘附、细胞分选和细胞融合的过程可迅速聚集、生成组织，然后开始合成在组织中提供和保持理想的几何形状和机械性能的细胞外基质。
为了解决这个问题，“4D打印技术”应势而生。所谓“4D打印技术”，就是在传统3D打印技术中再加入“时间”变量，不仅包含3D的长、宽和高3个维度，更增加了一个时间维度，使打印出的物体可以随着时间推移在形态结构上自我进行智慧调整，最终自动达到预先设计要求。此外，与其他的细胞沉淀技术像电喷雾和细胞喷射法对比，会发现由于电喷雾针头直径的限制，导致较低的空间分辨率。另外，螺杆挤压法对材料要求很高，只有材料满足高温软化，低温硬化需求时，才能生成细胞组织。
4D生物打印示意图A)基于材料的变形的4D生物打印。 (B)基于组织工程构建成熟的4D生物打印
第一种是指打印“智能”材料，通常是利用响应材料的固有的属性或功能，能够在外部刺激的情况下重塑自己。这种技术是类似的一些著名的现象，如自折叠，组装和拆卸等。第二种就是在一定的时间内，打印细胞的细胞“微组织”，使它可以通过细胞膜，在细胞内自我成熟，并逐渐形成功能组织。
作为一种新技术，4D生物打印会创造很有前途的解决医疗需求的方法，如组织再生，同时4D生物打印会在生物医学领域得到广泛应用。但是，4D生物打印技术和概念还没有的得到研究人员的广泛认知，这篇文章的主要目的就是为了提高公众尤其是研究人员对4D生物打印技术的认识。动脉网（微信：vcbeat）为你梳理了4D生物打印技术的原理和近几年在组织工程与药物递送方面的研究进展。
随着材料科学的进步，3D打印已经成功的打印出各种聚合物、脂类、液态金属材料。4D生物打印技术的材料是响应生物相容性材料，这些材料能根据外界刺激转变功能重塑形态，这些刺激包括温度、水、磁场等等。利用3D打印的技术基础和响应材料，引入“时间”第四个维度，可以制造出更复杂的类似于肝和心脏原生组织结构。因此，这会对功能组织或器官的生物打印做出重大贡献。
生物打印最常用的刺激是温度。温度变化时，温敏材料可以折叠、收缩或膨胀，某些聚合物的相变温度接近生理温度。一个典型的材料是聚化合物PNIPAAm，它是一种广泛应用在药物传输和组织再生的材料。例如，PNIPAAm和水不溶性聚合物PCL组成的双层结构，可以在温度变化时自我展开、折叠，这个结构可以用于酵母细胞封装和释放，如下图所示：
（A）生物打印的材料对温度的响应。（I）折叠星形聚合物双层结构示意图。温度降低时，温敏水凝胶溶胀和折叠成一个胶囊状结构。(ii) 温度升高时，胶囊会打开并释放封装的细胞
另一个典型材料是PNIPAAm和陶瓷粉末聚合物，它可以在热刺激下进行溶胶-凝胶的转变。通常，这个过程会混合热敏聚合物与细胞、营养和生长因子。将这些聚合物注入人体后，由于温度的增加，该聚合物发生一个相变，形成一个凝胶，从3D结构中释放其中内容。
生物打印另一个刺激是水。材料变形是由于材料在不同支架间隔内吸水膨胀程度不同。生物打印支架放入水中以后，会随着时间的推移和空间位置的转变，吸水程度发生变化，然后膨胀为不同的形状。例如包括不同分子量的双层PEG膜打印过程，如下图所示：
（B）在水刺激下生物打印支架的变形 (i–iii) 双层PEG膜的制备示意图(iv)双层的PEG水凝胶自我折叠概念图。(v) 典型荧光图像显示Hoechst染色的纤维细胞（蓝色）封装在凝胶层内部，Calcein-AM染色的纤维细胞（绿色）封装在凝胶层外部。
PEG双层膜在水溶液中的差分溶胀引起支架的自我折叠变形，然后细胞被封装在PEG双层膜内，细胞载货支架在水下自行折叠成不同半径的圆筒，这样的折叠不会对细胞活性造成影响，8周后，这些细胞存活率高达90%。只要设计合理，这样的3D生物打印响应支架可定制各种与解剖相关的微观几何形状。
在磁场的作用下，磁敏感材料也可以成为生物打印的一种刺激。在打印过程中，所施加的磁场可以控制定向打印含有磁化的硬血小板的各向异性粒子。另外，可以采用多机和双组分混合单元控制打印材料的局部成分，将多个材料组合成一个单一的几何结构。这种方法可以制造多种多样的功能结构来高度模仿自然界的生物结构。
不同4 D生物打印技术的对比
通过外部刺激变形的生物打印材料，可以创建高度复杂的组织。这个目标也可以通过封装在生物打印支架内的自组织细胞完成。在3D打印出来的生物材料支架中精确的嵌入活细胞和生长因子，可以获得与天然组织结构非常相似的工程化组织结构。然而，由于不完整的组织的形成过程，打印的组织结构还不能实际的应用。细胞膜、细胞自组织和基质沉积的过程可以促进打印组织结构的成熟。组织成熟技术的引进使3D生物打印获得具有与天然组织相媲美的功工程化组织结构，促使3D生物打印技术向4D打印技术的进步。
细胞膜
在工程血管的内腔涂层构建内皮细胞膜是4D生物打印技术打印成熟血管广泛采用的手段。涂层的内皮细胞膜可以减少血栓形成，防止血管阻塞，保证移植的打印血管内血液正常流通。通过去除打印后的水性保护油墨成功地获得嵌入了工程组织结构的血管。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）悬浮液注入管状血管以促进内皮化。48小时后，人脐静脉内皮细胞层在打印的血管内腔成功的融合。如下图所示：
共聚焦图像显示在打印结构的微通道壁上涂一层人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）
细胞自组织
4D生物打印技术采用细胞自组织构建包含有人体平滑肌细胞的细胞球体环状血管。离散细胞球体被打印成紧密地环形结构，然后，球体粒相互兼并，由于细胞自组织形成一个环状血管。如下图所示：
（B）（I）由人的平滑肌细胞打印的环状血管组织结构，以绿色和红色荧光染色无细胞混合的离散细胞球体；(ii–iv)细胞球体粒相互兼并形成环状血管
同样的，管状移植也在细胞自组织的帮助下完成。为了构建管状结构，包含人卵巢颗粒细胞的细胞螺旋管被打印成小直径毛细管。打印后，每个环形会形成72小时的细胞自组织过程，就导致彼此之间的环形间隙关闭，并形成结缔组织管状移植。打印的管状移植内的活细胞通过不同信号分子相互连通，并在基质内调整它们的位置，形成结缔组织和一致的管状移植。细胞自组织的过程，促进了打印生物组织技术的成熟，为组织移植提供了必要的机械性能。
基质沉积
类似细胞膜和细胞自组织，细胞内的基质沉积促进了4D生物打印技术的成熟。水凝胶由于其良好的性能经常应用在在3D生物打印，优点有水分含量高、易加工、与封装细胞有良好的生物相容性等。但是，水凝胶也有缺点，比如它会快速降解，这样就阻碍了组织工程基质的最终强度，威胁打印构建的完整性。为了解决这个问题，人骨髓间充质干细胞(hMSCs)被接种到生物打印组织构建网格中，由于人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的基质沉积和环境重塑，组织在介质中的降解时间从2天延长到两周。如图所示：
（c）（I）具有网格图案的一个四层打印矩阵的内部结构 比例尺 = 500 μM（II）通过从人骨髓间充质干细胞（MSCs）基质沉积，打印重建的网格图案。
由于从细胞基质沉积，网格状图案保持足够的强度，因而可以被处理。嵌入式细胞的基质沉积和优化降解过程对于功能性组织工程来说是非常重要的。综上所述，在生物打印技术中加入时间的维度，使打印的组织结构越来越成熟，和自然的组织结构也越来越像。
由于4D生物打印技术固有的优势，它在生物医学领域得到非常广泛的应用，如组织再生和药物载体。他的优点包括：（i）在基于响应材料的3D复杂组织结构基础上，可以根据环境变化，改变形状和功能。（ii）在可编程的框架内打印细胞群体，使打印的组织机构与自然的组织相似。下面，我们讨论了几个在组织工程和药物传递使用4D生物打印技术的例子。
组织工程
最近，由于4D生物打印技术的飞速发展，体外构建仿生血管的研究有望实现。例如，自折叠聚合物可以通过封装不同类型的细胞来制造血管，并可以在水中形成多层管状结构。另一种方法是通过4D生物打印中的细胞自组织能力来制造血管。
血管生成是组织工程学中的关键问题，由于血管需求量大，因此这个问题急需解决。血管是维持细胞功能的主要场所，为细胞提供营养和氧气，同时排除细胞代谢废物。在距离超过100–200 μM的时候，质量扩散是为组织提供营养的唯一有效方式，但是这种方式在缺乏合适的血管时就会限制组织的尺寸。4D生物打印技术为解决这个问题提供了可能。通过层叠的生物打印，在水凝胶中的细胞可以被打印成类似血管的圆柱形，然后在成熟因子的作用下，血管细胞迅速成熟，形成血管。举例来说，多种类型的细胞，如骨髓间充质干细胞，成纤维细胞，内皮细胞，利用4D技术可以在水凝胶中打印成各种图案。细胞迁移和聚集发生在为期16天的培养过程中，16天后就会形成完整的血管结构。在这种情况下，几个因素，包括生长因子、EC–MSC的相互作用，ECM组件，血液动力学和机械因素，可以影响功能性血管系统的形成。3D组织结构可以很容易地被制造出来，网络可以通过渗透压梯度的折叠成复杂的结构，这样的结构具有制备血管组织结构的巨大潜力。因为有限的分辨率的系统，这个系统无法形成一个小规模血管结构。
与上述使用残余应力和弹性模量形成血管不同，另一种方法是通过细胞在细胞外基质或细胞底层所产生的切向张力进行自我折叠。二维图案的微孔板在细胞牵引力的作用下沿着对角线滚动。并且，管的直径可以通过改变对角线的角度进行调整。现在已经使用由牛颈动脉内皮细胞及人脐静脉内皮细胞制作的圆柱管来制造血管。
生物打印出来的琼脂糖杆也被用来制作血管，这项研究成功的设计出具有特定几何形状的血管。如下图：
(A)采用4D生物打印技术制造血管样结构。(i)根据琼脂糖杆模板打印出人皮肤成纤维细胞球体并组装成血管样结构。 (ii) 组合管中被荧光标记的红色和绿色的细胞经过7天的培养，逐渐融合成熟。 (B)经过3天的融合，人静脉平滑肌细胞与人皮肤成纤维细胞根据特定的模式进行组装。
根据琼脂糖杆模板打印出人皮肤成纤维细胞球体并组装成血管样结构，经过培养逐渐融合成熟。然而，由于琼脂糖填料的去除，他们形成更复杂的结构的能力受到限制。对4D生物打印技术来说，上述方法降低操作难度和有潜力制造相对大的血管组织。然而，这些方法只能制备只有一层的简单结构，而人的血管往往包含三层结构（即，成纤维细胞、血管平滑肌细胞、和VECs），要制造一个完整的血管结构，就必须包含这些细胞和结构层。
4D生物打印技术也被用来打印像骨骼这样的硬组织。先打印一种具有网格图案的聚合骨，为了移植矿化再在骨头上涂上下鼻甲组织来源的间充质干细胞。经过短暂的培养期，打印的骨组织移植变得成熟。对脱细胞移植物在体外和体内研究发现，它具有改进的骨诱导和骨传导的性能。然而，移植的骨骼没有天然骨的机械强度。还需要进一步努力提高这些打印出来的骨组织的强度。
药物输送
4D生物打印技术可以精确控制不同的组件的空间分布，这样就可以以可编程的方式释放或封装药物和细胞。例如，包裹水滴的小油滴被称为“multisomes ”，它可以在水中被打印。如下图所示：
(A)通过改变PH值从multisome释放封装的水滴，multisome是由涂料和油酸组成的混合物，包含共轭荧光葡聚糖- 4和Ca2+离子。用荧光显微镜观察multisome在水中的扩散。
液滴相互粘附，形成界面双层膜。当周围环境的温度或pH值发生变化时，液滴中的物质可以被释放。这么一个multisomes框架可以作为一个小型的生物反应器，可以用在药物或细胞传递上。multisomes也可以通过膜蛋白而功能化。例如，利用蛋白质，在multisomes之间设计一个专门用来传递电信号的通道。multisome网络也可以通过渗透压梯度程序，使他们能够打开和折叠形成复杂的结构，并在这个过程中封装、释放药物，达到传递药物的目的。示意图如下所示：
（B）自折叠形成的液滴网络。 (i) 两滴不同渗透压的液滴通过脂质双分子层的示意图，双层膜的水的流动引起液滴的膨胀或收缩。 (ii)包含两条不同渗透压液滴的网络，可以变形产生一个曲线结构。 (iii) 自发地折叠成一个空心球的花形网络，橙色和蓝色滴最初包含80 毫克氯化钾和8 毫克氯化钾。
另一种方法还利用差异溶胀聚合物水凝胶层形成自折叠装置，可以实现定向的封装和释放药物。该装置使用两个溶胀层和一个粘附层来装药。这个双层结构是包含不同溶胀率的双层结构，一层是由PMAA构成的pH敏感水凝胶层，遇到液体就膨胀。另一层是由PHEMA组成的不膨胀层。这个装置由于双层膜的不同溶胀率会自行折叠成粘液，这会明显促进粘膜粘附。PHEMA层也可以变成扩散屏障层，减少药物在肠道内的流失。牛血清白蛋白被封装在双层结构，作为药物成功的穿过粘膜后被释放出来。
总的来说，4D生物打印技术就是在3D打印的基础上增加“时间”这个第四维度。它的实现方式主要是两个，一个是基于材料的变形，另一个是基于组织工程构建的成熟。4D生物打印技术在获取组织功能结构，通过刺激引起的结构变形、控制药物释放等领域已经取得进展，但是仍然处于起步阶段，有很多的问题需要解决。
首先，可以用来打印的响应性材料是有限的。大多数材料只对一种刺激有反映。然而，在人的身上，复杂的微环境是由多个系统监管来维持稳定的，如神经调节、体液调节和自我调节等。所以，能够响应多种生理信号的自变形打印材料对于4D生物打印技术的医学应用是非常有利的。例如，4D打印的微胶囊可以在胃酸的刺激下自我变形，当到达胃溃疡伤口处时，他们的形态即能够覆盖伤口又可以防止胃酸进一步的腐蚀。除了发现新的材料，使现有的响应材料能够被打印和同时解决生物排异性问题也是未来的研究方向。
第二，4D生物打印技术现有的结构变形只是简单的变形，如折叠、展开、自组织等。主要是因为这些变形发生在宏观尺度上，制约了打印对象的演化过程中的精确控制。
未来的一个工作任务是通过调节外部刺激精确控制4D生物打印方向、功能、形状等微观的东西。提高打印分辨率可能是实现变形的精确控制一个方案，我们应该投入更多的精力来研究敏感的生物材料，来提高打印分辨率。基于细胞成熟4D生物打印技术，如能控制细胞排列，就可以更好地模仿体内组织。例如，例如，血管通常包括三层：内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。利用4D技术，如果细胞定位（尤其是平滑肌细胞的方向）可以控制，结构可以功能化，这样打印出来的物质会更像人体的。总之，4D生物打印技术为生物工程打开了一扇新的大门，它将作为一个新工具用来解决组织工程和药物传递方面的问题。
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作者：王晓行
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