阐明生物膜钙离子转运的分子机制 - -基于ATP的蛋白质运输机制方面的新见解-
阐明生物膜钙离子转运的分子机制 - -基于ATP的蛋白质运输机制方面的新见解-
由理化学研究所(理研)计算科学研究中心粒子系生物物理研究小组的杉田有治小组组长(开拓研究总部杉田理论分子科学研究室主任研究员)、小林千草技师、约翰·杰恩研究员(开拓研究总部杉田理论分子科学研究室专职技师)等共同研究小组， 利用计算机模拟计算了钙离子泵控制细胞内钙离子转运，将钙离子释放到囊泡体[1]的过程，明确了钙离子转运的分子机制。 本研究中揭示的机制，被认为是以三磷酸腺苷( ATP ) [2]为能量来源通过生物膜进行运输的蛋白质中的很多共同点。 生物体内有各种各样的离子泵在工作，其功能不全会导致严重的疾病。 详细了解离子输送的分子机制，有望对制药医学的发展做出贡献。 此次，联合研究小组利用超级计算机“OAK Forest-Pacs”[3]和“京”[4]，对钙离子泵内存在的钙离子向囊泡体释放的过程进行了分子动力学( MD )计算。 并且计算了这个过程中蛋白质的结构变化和周围的影响，发现膜分子和蛋白质内的过渡性相互作用稳定了这个过程的中间状态。 现在，联合研究小组正在利用“富岳”的高运算性能，以阐明各种离子泵的离子输送机制为目标进行研究，为相关疾病的阐明和制药做出贡献。 本研究将于近期刊登在科学杂志《美国科学保护协会( PNAS )的在线版上。
钙离子泵中离子排放的分子机制
背景 ATPase(ATP酶)是水解三磷酸腺苷( ATP )磷酸键的酶的总称，它将水解得到的自由能转换为其他功。 ATPase分为几组，其中，p型ATPase存在于生物膜内，是利用水解的能量掌管离子等向膜内外输送的蛋白质。 p型ATPase存在于所有生物中，在运动、代谢、传递等生命活动中发挥着重要的作用。 已知这些蛋白质逆膜内外的巨大浓度差输送着各种各样的离子。 典型的p型ATPase之一钙离子泵( SERCA )存在于肌细胞的囊体膜中，抵抗1万倍的浓度差将钙离子输送到囊胞体内。 通过这种运输，调整细胞质内的钙离子浓度，肌肉松弛。 SERCA可分为三个细胞质结构域[6](A，n，p )和螺旋[7]组成的跨膜区(图1A )。 腺苷二磷酸( ADP ) [2]和ATP与细胞质结构域的n、p结构域的边界结合，钙离子与跨膜部位[8]的中央结合。 2000年进行最初的x射线晶体结构分析[9]以来，了解了各种化学条件下的晶体结构，发现它们的结构有很大的差异。 从这些实验研究中，钙离子输送在多个步骤中发生，SERCA的结构变化起着重要的作用。 但是，由于实验上很难测定在这些过程中是如何发生结构变化的，所以详细的分子机制还没有明确。 特别是，结合在SERCA上的ADP解离，钙离子排出囊泡体内的步骤(从E1P状态到E2P状态)中，生物化学实验显示了中间状态的存在，但其分子结构没有被解开(图1B )。
图1钙离子泵( SERCA )的结构和从E1P状态到E2P状态的变化
( a )钙离子泵( SERCA )是存在于囊体膜中的膜蛋白，分为三个细胞质结构域( a、n、p )和螺旋组成的跨膜区。 将钙离子从细胞质侧向囊泡体内输送。 ( b )从E1P状态到E2P状态的过程中，结合在SERCA内的ADP和钙离子解离，钙离子向囊泡体内排出。 这个过程发生了很大的结构变化，而且生化实验表明存在亚稳定的中间状态，但详细的分子结构目前还不清楚。
研究方法和成果 联合研究小组着眼于结合SERCA的钙离子从排出囊泡体内的E1P状态到E2P状态的步骤，进行了各状态下的分子动力学( MD )计算。 并且计算了两种状态之间的联系路径，分析了结构和能量。 这些计算使用了联合研究小组开发的分子动力学计算软件GENESIS。 GENESIS拥有独特的高速并行化方法，可以发挥“京”和“富岳”等超级计算机的性能进行大规模并行计算。 并且，将字符串法导入到了GENESIS中。 字符串法是一种通过沿称为映像的初始路径准备具有不同结构的模拟系统的副本，并对各个副本同时进行MD计算，来搜索连接两种状态的路径的方法(图2 )。 通过开发这样的方法软件和利用“京”出色的运算能力，可以分析单体MD计算无法实现的较大膜蛋白的E1P状态和E2P状态之间的路径。
图2本研究中使用的串法的概要 串法是求出连接E1P状态和E2P状态的路径的方法之一。 作为计算方法，准备由连接两个状态的不同结构构成的复制品(图像)，同时通过将自由能最小化来优化整个路径。 本研究最多利用了64个示意图。 由于需要通过多台计算机进行并行计算，因此这是没有超级计算机无法实现的研究。
计算结果表明，沿这一步路线的SERCA分子结构清晰，可分为五个子步骤(图中所示为三个子步骤) (图3 )。 在第一个子阶段，ADP解离导致细胞质结构域A-N之间的被称为盐桥[10]的离子相互作用中断，从而发生结构变化。 随后，由于a结构域发生旋转，p结构域发生倾斜，细胞质结构域和跨膜区之间的环[11]被提拉。 其环的运动以膜贯通部位螺旋的重组的形式传递过来，最终明确了将膜贯通部位的钙离子键部位的小胞体侧的闸门打开。
图3 SERCA在离子排放过程中的结构变化 ( a )用颜色表示了SERCA路径上的代表性图像( image10、23、31、44、57 )间的结构变化。 在同一颜色的部分内，作为域以统一的状态配置发生变化。 ( b )观察了细胞质侧区域间边界部分的每个图像的相互作用。 左侧是在最初期，A-N结构域之间的盐桥(离子相互作用)被切断。 在中央和右侧，a结构域和p结构域的残基之间过渡形成疏水性相互作用。 ( c )左侧在膜贯通部位的细胞质侧，M2、M4螺旋间隔开。 右侧在膜贯通部位的囊泡体侧，钙离子结合部位的囊泡体侧门--m 4、M6螺旋间隔开。
另外，通过详细观察阶梯的细胞质结构域和跨膜部位的原子间的相互作用，还表明在它们的中间状态下，细胞质结构域边界过渡地形成疏水性相互作用[12]，在跨膜部位过渡地形成与膜分子的相互作用，从而稳定了各自的中间状态(图4 )
图4钙离子泵中离子排放的分子机制 此次研究表明，SERCA在E1P-E2P状态间的囊泡体排出的分子机制。 在第一个子步骤中，A-N域之间的相互作用中断，从而A-N域开始旋转。 在第2个子步骤中，通过a结构域与p结构域发生过渡的疏水性相互作用，使p结构域倾斜，从而改变附近的跨膜部位的结构。 膜分子进入膜贯通部位，使中间状态稳定化。 最后，小胞体侧的闸门打开，钙离子向小胞体侧排出。
今后的期待 p型ATPase在以ATP为能源的膜内外的物质输送中起着重要的作用。 这些蛋白质中，即使输送的物质不同，蛋白质的结构也是相同的。 因此，本研究表明的与SERCA运输相关的分子机制也有可能适用于钠钾泵和质子泵等各种p型ATPase。 这些泵在生物体内起着重要的作用，由于也发现了这些功能不全导致的疾病，因此被认为是重要的创药目标之一。 虽然了解离子输送的分子机制是生命科学的基础研究，但其本质的理解期待对各种制药医学的发展做出贡献。 为此，有必要使用从“京”到“富岳”，再到将来可以使用的具有更高运算能力的计算机，继续进行尖端的计算科学研究。
补充说明 1 .囊泡体 真核生物的细胞器官之一，被生物膜包围。 虽然与蛋白质合成等有关，但对细胞来说也有钙储藏库的作用。 2 .三磷酸腺苷( ATP )、二磷酸腺苷( ADP ) 由于三种磷酸是生物普遍存在的磷酸化合物之一，因此被称为三磷酸。 通过水解，一个磷酸解离后就变成了二磷酸腺苷。 通过水解得到的能量被利用于各种生物功能，因此被称为能量货币。 3 .超级计算机“Oakforest-PACS” 由东京大学信息基础中心和筑波大学计算科学研究中心共同运营的、最先进的共同HPC基础设施( JCA HPC:JOINT center for Advanced High Performance computing )所拥有的超级计算机。 是国内最大的搭载了8，028台基于Intel Xeon Phi处理器的门核型机器的超并行计算系统。 4 .超级计算机“京” 作为文部科学省“建设创新性高性能计算基础设施( HPCI )”计划的一环，理化研究所和富士通公司共同开发的超级计算机。 拥有约10比索的处理能力。 2012年开始共用使用，2019年结束使用。 5 .分子动力学( MD )计算 一种计算机模拟方法，通过粒子(原子)之间作用的相互作用力来求解运动方程式，从而求出微小时间后的原子坐标。 由于要求分子运动需要大量的重复计算，因此原子数变多则需要大量的计算资源。 6 .域 是指蛋白质中具有紧凑立体结构，与其他部分独立的结构、功能的部分。 蛋白质大多由多个结构域组成，成为单元。 7 .螺旋型 蛋白质的二级结构之一，具有螺旋状的结构。 8 .膜贯通部位 蛋白质中存在于生物膜内，贯穿膜的部分。 9.X射线晶体结构分析 根据用x射线照射晶体得到的衍射数据分析原子分子结构的实验方法。 通过对蛋白质进行结晶和分析，可以获取蛋白质的立体结构信息。 10 .盐桥 是指蛋白质内，带正电荷的残基和带负电荷的残基之间发生作用的离子性相互作用。 11 .环路 蛋白质内不具有决定的二级结构的部分。 灵活，可以采取各种结构。 存在于不同的二级结构之间或域之间。 12 .疏水性相互作用 非极性(分子内无电荷偏差)分子在水等极性溶剂内避免与溶剂的相互作用，非极性分子之间缔合的作用。
联合研究小组 物理化学研究所 计算研究中心粒子系生物物理研究小组 队长杉田有治 (开拓研究总部杉田理论分子科学研究室主任研究员、生命功能科学研究中心分子功能模拟研究小组组长) 工程师小林千草 (运用技术部门软件开发技术单元技师) 研究员约翰·杰恩( Jung Jaewoon ) (开拓研究总部杉田理论分子科学研究室专职技师) 埼玉大学研究生院理工学研究科 准教授松永康佑
研究支援 本研究由理化学研究所运营费补助金(生命功能科学研究、riken pioneering project“动态结构生物学”、“智能交通工具环境”)进行。 文部科学省后“京”重点课题(1)“通过控制生物分子系统的功能构筑创新的制药基础”、该“富岳”成果创造加速计划“通过全原子粗视化分子动力学阐明细胞内分子动态(课题代表者:杉田有治)”、 在“推进加强心理疾病的创药大数据整合系统(课题代表者:奥野恭史)”、日本学术振兴会( JSPS )科学研究费补助金基础研究( s )“通过多尺度分子动力学模拟阐明细胞内分子动态(研究代表者:杉田有治)”中 此外，分子动力学模拟由理研“京”、HOKUSAI GreatWave/BigWaterfall、最先进的联合HPC基础设施( JCAHPC )“Oakforest-PACS”(课题编号hp170254，hp180201 )组成
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