Qsep100 TM全自动核酸蛋白分析系统操作步骤
Qsep100
01
Qsep100TM使用步骤(以S2为例）
1.1｜软件界面
打开 Qsep100TM 全自动核酸蛋白分析系统主机和空气压缩机的开关，双击软件图标，点击 New project, 设定Project 名称与存储路径（Browse）（图 1）。不新建也可以，结果会自动保存在 C 盘 rusult 文件夹里。
图1 New project
1.2｜连接 Qsep100TM与初始化设定
（1）
联机与通气检查
点击 Connect（图 2， A）（仪器图片会从灰色变为彩色，表明联机成功）；随之会弹出PurgeCheck 提示窗（图 3-1），点击 Purge check 进行通气检查， 根据提示操作：也可直接Skip，跳过不做。
图 2 主控页面
图 3-1 联机通气检查
（2）
放入缓冲液和 Marker
a、 点击 Change Buffer（ B）， P（ Park）、 W（Wash）、 C（ Clean） 位置为清洗槽，放蒸馏水， S 位置放 Separation Buffer（图 4）。注：RNA 的 seperation buffer 需要稀释 10 倍后使用。
b、 在左侧的 MA1 孔中放置 20bp-1000bp 的 Alignment Marker， MA2 孔中放置对应的Size Marker（ C109200-100），在 MB1 孔中放置 20bp-5000bp 的 Alignment Marker， MB2 孔中放置对应的 Size Marker（ C109300-100）（ 图 5）。用食指和中指托住底部，用拇指将管子按压到底。
注： P、 W、 C 和 S 槽中的液面高度以缓冲液槽的刻度线处为宜， 不能低于槽体积的2/3；MA1、 MA2、 MB1 和 MB2 均取 20-30µl，再覆盖 20-30µl 矿物油（ Mineral Oil） 防止挥发，应避免气泡产生，若有气泡，请离心。 Alignment marker 和 size marker 体积若低于 15ul，应当进行更换。
图 4 置换缓冲液和 Marker
图 5 缓冲液和 Marker 位置
（3）
放入样品并复位
点击 Change Sample（A），放入样品，关上样品门；点击 Park（C），使样品盘复位。
注：样本体积不少于 10ul， 15ul 以上最好。（样本体系配置需要用 1×Dilution buffer，应避免用 H2O）。放置样本和缓冲液后，请确保点击 park，将样本盘回归原位，再点击 Run。配送的 DNA 和 RNA 的 Dilution buffer 请均先用无酶水稀释 10 倍后使用。
1.3｜卡夹置入与校正（以 S2 卡夹为例）
（1）
置入卡夹
打开仪器上方的卡夹门，放入卡夹（凹槽向前），关闭卡夹门（图 6）。注：全新高敏卡夹 N1 卡夹检测样本时， ladder 需要用 Dilution buffer 原液稀释 5/10 倍后使用，且进样时间为相应的 5s/10s。
图 6 置入卡夹
（2）
卡夹锁定和校准
点击 Latch，卡夹图片颜色变成彩色，左侧跳出卡夹信息（Cartridge Information），包括卡夹序号（Cartridge Number）、 过期日期（Expiration Date）和剩余可用次数(Runs Left)（图 7）。
a、 若置入的是新卡夹，则软件会在 Latch 后弹出 Calibration needed 窗口，点击'确定’进行高压通胶检查（HV check）（图 8-9）。注意：新卡夹需用大头针扎孔后再使用。
全新卡夹的初次使用
（1） 使用前需用配套的大头针在卡夹的顶部扎孔，注意将针扎至底部。按照仪器提示对卡夹进行 HV Check 和 Calibrate。
（2） 卡夹使用结束请插回卡夹壳子中，卡夹请保持竖直放置，不要平躺。
（3） 卡夹可常温保存，若是冰箱 4 度保存，使用前请先常温放置 30min 后使用。
图 7 卡夹锁定
图 8 高压通胶检查信号图
图 9 高压通胶检查通过
高压通胶检查（HV Check） 通过后， 点击 Calibrate， 系统提示是否要进行卡夹校正（图 10）， 点击'是’， 系统默认卡夹初次校正的电压为 8KV。卡夹校正成功后点击'确定’（图 11）。
图 10 卡夹校正
图 11 卡夹校正成功
b、 若置入的是已用过的卡夹，则在点击 Latch 后， 点击 Tool→Recalibrate 进行卡夹重新校正，在弹出的选项框中选择合适的 Voltage（电压） 和 Alignment Marker（内参） 类型，点击 Start Calibration（图 12），校正完成时会弹出 Calibration succeed 窗口，点击确定（图13）。
图 12 卡夹重校正（Recalibration）
图 13 卡夹重校正成功
1.4｜程序设定（图 14）（以 S2 卡夹为例）
（1） 单击 Sample Position 下方的空白格（A），弹出 96 孔盘模拟图（图 15），于左侧选择所放样品位置，可单选，也可点击右侧 A-H 或下方 01-12 坐标以直接选取一行或一列，双击右侧相应位置处输入样品信息（Sample ID），设置完成后点击 OK；
图 14 程序设定
图 15 样品位置选择
（3）单击 Method 下方的空白格(B)，弹出测试方法选择框（图 16），选择适合的 AlignmentMarker 和 Method（注意：所选方法的电泳电压要与卡夹校正时的电压一致），选好后点击OK；Sample Duration（吸样时间）、 Runs（检测重复次数）和 Separation Duration（分离时间）可以根据样本情况灵活设定（双击输入）；
图 16 电泳方法选择
（4） 在 Result Name 里输入一批样品的名字，在下面选项框中选择 Sample ID；
（5） 点击小计算器图标（C），弹出 Calculate Flow 框， 文库样本的建议参数如图 17 所示。勾选 Calculate，点中 Create size marker， 下面的 Size marker injection time 选择 5s， 点击 OK（为保证实验结果的准确性，建议每天或每批样本新建一个 Size Marker）；
图 17Size marker 的选择
（6） 程序设好后， 点击 Run，开始电泳分离（图 18）。使用者可点击 Real time 实时监测电泳过程。注意：点击 Run 后不能打开样品门，否则运行自动停止！
图 18 启动程序
检测结束取卡夹时，先点 Unlatch 解锁后打开卡夹门。Latch 状态下勿多次重压按压卡夹门。
02
数据结果分析
2.1｜打开检测结果
样品检测完成后，点击 Open file，选中目标结果文件， 打开（图 19-20）。
图 19 打开结果文件
图 20 结果文件显示框
2.2｜常用数据处理
（1）
参数调整（尤其是文库样本）
对于文库样本，建议在 Run 之前，点击图 21 中小计算器图标，在弹出的图 22 中，将Baseline factor 预设的 200 调整为2000 后再 Run， Baseline factor 设定越大，基底值越平滑， 利于文库面积和 smear 的计算。
图 21 计算方法选择
图 22 Baseline 调整
在您获得实验结果之后，系统会自动判断实验结果中的 Peak。若您不满意自动判断的结果，可利用 Parameter 功能来更改。
将想重新计算的结果文件勾选上， 点击 Parameters，弹出图 23， 其中主要有三个功能：
a、 Baseline factor 会改变基底值（ Baseline） 的判断，预设为 200， Baseline factor设定越大，基底值越平滑，较小则基底值容易受到讯号的影响而起伏，可调整为 2000 后重新计算结果（若 Run 之前已经改成 2000，此处可忽略）。
b、 Peak smoothing 会改变原始数据的显示， 显示的峰值个数会变少， 使其变得更为平滑；Peak smoothing 指定的值越大，数据便会越平滑同时降低讯号强度，从而可以減少因为杂峰而产生的错误讯号。
C、 Peak threshold 可以改变判断为 Peak 所需的讯号强度，当 Peak threshold 指定的值越高，要被判断为 Peak 所需的讯号强度也越强，若指定的值越低，則所需的讯号强度越低，较容易能得到一些较低浓度碱基对的 Peak，但同時也较容易受杂峰影响。
再勾选上下面的“Apply to all selected files in list”和”Save file after new parameters applied”两个选项，再点击'Apply’。若同样的样品却采用不同的实验数据 参数设定，可能会造成您在判读数据上的混淆，故请斟酌调整。若想要恢复原始数据，可以按下 Default 按键，即可恢复原始数据。
例如：将 Baseline factor 从 200 调到 2000，将 Peak definition 从 3 调到 6， 则原数据结果图为图 24 的，可以被调整为图 25， 可见杂峰数值明显减少。
图 24 初始结果
图 25 参数调整后
（2)
核酸、文库等样本的 smear 分析及区间百分比
例如：想计算下图（图 26）游离 DNA 样本的区间百分比，则需点击右侧的 Smear选项，弹出图 27，可以手动拖动虚线，选定自己想要的区域，也可输入固定的 bp 大小区间（From……to……），点击 Apply，再把 Interval 的值从 100 调成 1000， Apply 一下，右下角即可显示该样本该区间的百分比占比及 avarage bp。如果 Interval 的值是100 或者其他任意数字，代表的就是虚线区间内，软件会自动以 100bp 为区间分段， 计算每段 100bp 的核酸占量百分比和 average bp（看实验要求自己选择）。样本多的时候可以全选样本，通过总 Smear 功能进行批量处理（图 28）。
图 26 游离 DNA 样本结果（示意图）
图 27 Smear 框
图 28 批量样本 Smear 分析方式
(3)
样本重新计算
当您想用另外一个 ladder 文件计算当下样本时，您先勾选需要重新计算的样本后，点击 Calculate 计算器图标（ 29），再通过 Load 按键载入您已经另存好的尾缀名为 rfm的 Size marker 文档，勾选“Apply to selected files”和“Save file after calculation”来保存文档信息（图 30）， 按下 OK 按钮。
图 29 Calculate 计算器
图 30 Calculate 计算框
2.3｜新建比对档
点击 Comparison→New Folder，用鼠标将计划处理的结果拖进 New folder 框内（图 21）。勾选 Time Alignment（时间对齐），点击 Apply all；勾选 Signal Alignment（信号基底值对齐），点击 Apply all；Signal offset 调为'-1’（ '-1’是 ladder 在上样本在下的方向错开，也可以选择'+1’，会变成 ladder 在下样本在上的方向）， 点击 Apply all（可点击多次），调整结果间距（图 31）。若想让胶图里 Ladder 条带 bp 标注在泳道旁边，就选择峰图右侧列表里的 ladder文件右击，选择 Main Ladder 即可（图 32）。
图 31 新建比对档（New Folder）
图 32 显示胶图里 Ladder 条带 bp
2.4｜导出数据
(1)
导出峰图和胶图
于空白处右击，选择 Export signal chart，导出峰图。点击左上角的 Gel View，可展示模拟胶图， 于空白处右击，选择 Export gel view，导出胶图（图 33）。
图 33 导出结果图片
(2)
导出整个报告
于空白处右击，选择 Export report，选择导出报告的格式（Report Type）；若检测的是PCR 产物，则选择 Standard(DNA)，若检测的是文库样本， 有做过 Smear 分析， 则选择 Smear，若检测的样品为 RNA，则选择 RNA，若有建立 Peak calling table 信息，则选择 Peak calling。再保存即可（图 34）。
图 34 导出报告
03
常见问题解决
3.1｜Size marker 修正和样本重新计算（S2）
（1）
Size marker错误纠正
若 Size marker 出错，如下图（a）所示，在右侧数据栏找到正确的 low 和 up marker，通过右击设好。
（a） 错误的 Size marker
（b） LM 和 UM 的重设
（2）
删除杂带并拷贝数据
如果有杂带，就在右边数据栏里删去杂带(RFU 在 1 以下的，箭头指向点位于水平基线上的小小峰都可删去)。剩19条主峰。再在任意条带上右击选择Copy reference marker data。
注意：如果是 S1 卡夹，还会有 26bp， 160bp 和 162bp 及 238bp 和 242bp 都可分开，所以删除杂峰后剩余主带应该会有 21 条。不同分辨率卡夹， Size marker 结果条带会有差别，遵循一个原则即可（就是删除杂带后剩余的主带数和调用的模板里条带数一样就可以。
（ c） 删除杂带并拷贝数据
（3）
导入预制Marker
点击 Edit→Ref Marker，弹出图 d，点击左上角 Load
（ d） load 进来一个正确模板
在弹出的软件自带的所有 Marker 组合中，根据所用的卡夹类型，选用的电泳电压和 Marker 组合来确定一个对应的 Ref Marker 模板（图 e），此处以 S2-8-S109200-20-1K.ref为例:
e） 选择合适的 Reference Marker 文件打开
（3）
预制Marker矫正运行Marker
选中对应的 Ref Marker 打开后得图 f， Ref Marker 为 19 条带， 于图 f 任意行处右击，选择 Paste reference marker data，即可将前面第 2 步拷贝的自己跑的 Size marker 的出峰信息粘贴到这个模板上，与模板里正确的 BP 值组合，形成正确的 Sizemarker。右击左上方的 Save as， 另存， 即可用于后面样品结果的重计算。
图 f 粘贴出峰信息
选中需要重新计算的文件前面的小方框（步 1），点击 Calculate（步 2）， Load 进去上面保存下来的正确的 Size marker 文件（步 3）， 计算保存就可以了（步 4）。
图 g 重新计算的步骤
04
样本上机浓度
4.1｜文库/DNA 打断样本
上机浓度为 1-2ng/ul， S2 标准卡夹检测下限可到 0.05ng/ul。
4.2｜Cf/ctDNA 样本
Cf/ctDNA 样本: 终浓度 0.02ng/ul 以上的都可以上 S2 标准卡夹（可以提高进样电压或者进样秒数）；S2 卡夹检测不出则用高敏卡夹（N1）。
4.3｜ PCR 产物
上机浓度建议在 1-2ng/ul 左右，浓度很高时也可以通过减少进样秒数进行检测，检测下限为 5pg/ul。
4.4｜gDNA/FFPE DNA 样本
上机浓度 3-5ng/ul（Qubit 定量）， S2 标准卡夹检测下限可到0.5ng/ul，若是 Nanodrop 定量则上机浓度增加 2-3 倍。
4.5｜Total RNA 样本
上机前请先 95℃变性 5min，冰上放置 5min 后检测；上机浓度 10-20ng/ul（ Qubit 定量）， RNA 卡夹检测下限可到 0.2ng/ul，若是 Nanodrop 定量则上机浓度增加2-3 倍。
请扫码
给个关注
蘑菇头
学习 | 交流 | 分享
热点