TCGA分析+自测队列需要做什么才能发到17+?
前言
今天和大家分享的是2020年4月份发表在European Urology 杂志上的一篇文章(IF==17.947), “Next-generation RNA Sequencing–based Biomarker Characterization of Chromophobe Renal Cell Carcinoma and Related Oncocytic Neoplasms”。文章中作者基于TCGA和自测单细胞数据的肾细胞癌RNA测序数据，确定ChRCC中相对富集的基因FOXI，RHCG和LINC01187，并通过IHC和RNA-ISH分析，表明这几个关键基因可作为肾细胞癌的谱系特异性特征基因。
Next-generation RNA Sequencing–based Biomarker Characterization of Chromophobe Renal Cell Carcinoma and Related Oncocytic Neoplasms
RNA-seq测序分析肾细胞癌及其嗜酸细胞相关的肿瘤标志物
一、研究背景
肾细胞癌(RCC)是最常见的成人肾恶性肿瘤。由于多项临床、组织学和分子研究的发展，RCC分类从1997年海德堡分类的4个(1997海德堡分类)扩展到2016年世界卫生组织分类的12个亚型。最近全面的基因组和转录组研究揭示了不同组织学RCC亚型的特征性畸变。肾细胞癌(ChRCC)约占肾恶性肿瘤的5%，典型的大细胞型，细胞边界突出，胞浆淡至嗜酸性，核呈葡萄干状。嗜酸性粒细胞性ChRCC具有腺泡结构，丰富的嗜酸性细胞质，局灶性核褶皱。尽管大多数病例可以根据形态进行分类，但仍有病例显示出与其他分类相似的形态，包括透明细胞RCC（CCRCC），MiT家族易位性RCC（t-RCC），杂合性嗜酸细胞肿瘤（hybrid oncocytic tumor），嗜酸细胞型乳头状肾细胞癌（PRCC）和肾嗜酸细胞瘤（oncocytoma）。来自癌症基因组图谱(TCGA)的泛RCC研究表明，大约5–6％ CCRCC，乳头状RCC（PRCC）中包含的肿瘤和ChRCC队列最初被错误分类。作者基于TCGA肾细胞癌数据进行肾细胞癌及相关嗜酸细胞肿瘤生物标志物的鉴定。
二、研究思路
三、结果解读
No.1
谱系特异性ChRCC生物标志物的确定
使用TCGA、MCTP筛选ChRCC的RNAseq数据和来自其他RCC亚型和正常肾组织（图1a），limma确定2751个上调和2107个下调基因。基于两两比较ChRCC与CCRCC，PRCC和稀有RCC类型之间的差异，1268个基因作为候选的ChRCC生物标志物。然后根据其的表达水平和显著性进行排名， FOXI1、LINC01187、RHCG和HEPACAM2（HEPACAM家族成员2）基因排名最高。这些生物标记在scRNA-seq数据上被注释为基于谱系的特定基因（与插层细胞有关）。KLK15，LRRTM1和LINC00588被注释为癌症特异性基因由ChRCC表达的癌症特异性基因。这些基因在最初的TCGA ChRCC病例中升高根据组织学评估诊断为其他亚型，提示其可作为生物标志物。
图1 ChRCC生物标志物的确定
紧接着作者通过免疫组化方法在包含197个样品队列评估了FOXI1和RHCG蛋白并用RNA-ISH在162个样本队列同样评估了LINC01187。
图2.生物标志物在正常肾脏中的表达
No.2
转录因子FOXI1在ChRCC中表达显著
原发性和转移性ChRCC(图3a-d)的FOXI1免疫组化染色呈弥漫性、强阳性核染色。相比之下，其他RCC亚型如原发性CCRCC或转移部位未见染色。在肉瘤样ChRCC中，FOXI1蛋白染色仅局限于上皮样肿瘤细胞成分，包括上皮样细胞被梭形细胞包裹在肉瘤样成分中而高阶梭形细胞成分以阴性为主。所有嗜酸性ChRCCs显示FOXI1染色阳性。肾嗜酸细胞瘤和具有嗜酸细胞特征的未分类RCC也显示FOXI1阳性染色。所有评估的hot(最常见的是在Birt-Hogg-Dube综合征患者中遇到的)显示了一种双重表型，即只有一种肿瘤上皮细胞群fox1染色阳性，导致染色模式呈方格状。
图3.典型ChRCC
无原发性或转移性CCRCC、CCPRCC、原发性或转移性 PRCC、富马酸水合酶(FH)缺陷RCC、收集管癌(CDC)或MTSCC显示Fox1染色。8例原发性t-RCCs中有3例(37.5%)表现为非常弱，FOXI1核染色呈散在细胞，转移性t-RCC呈阴性(表1)。
表1.验证队列中FOXI1表达汇总
No.3
RHCG在ChRCC中的膜表达模式
之前观察到RHCG免疫组化染色方式如下:环周膜样染色、顶杯样染色和高尔基样/分泌样染色。原发性和转移性大鳞癌中发现弥漫、强环周膜性RHCG染色，而原发性和转移性大鳞癌中发现RHCG染色阴性。
图4.透明细胞肾细胞癌
但肉瘤样ChRCC显示上皮样肿瘤细胞成分中环绕膜状RHCG染色，包括包裹在肉瘤样成分中的上皮样细胞。嗜酸性粒细胞性ChRCC表现为高尔基样/分泌(6/10,60%;)或根尖杯状(4/ 10,40%)RHCG染色。所有嗜酸细胞瘤和低级别嗜酸细胞未分类的RCCs均显示尖杯状RHCG染色;热组的单肿瘤上皮细胞群也是如此，再次导致方格状外观。无原发性或转移性CCRCC、CCPRCC、原发性或转移性PRCC、Fh缺陷RCC、CDC或MTSCC显示RHCG染色。1 / 2的t-RCC病例表现为斑片状膜性RHCG染色。这一发现仅部分符合灶性/弱核FOXI1染色，转移性tRCC呈阴性，详细的数据如表2。
表2.验证队列中RHCG表达汇总
No.4
LINC01187在ChRCC中高度富集
通过对167个RCC样本的整个组织切片进行LINC01187 RNA-ISH。在最终分析中纳入的病例总数为162/167 (97%)，5例因阳性对照失败而被排除。32例典型chrcc中可见高水平的LINC01 187核表达(平均H值= 371;范围= 247-398)和5例转移性肾癌的18/18个转移部位(平均H评分= 368;范围= 308 - 400;图3g,3h)，原发性和转移性CCRCCs(图4g,4h)无表达(H评分= 0)。
表3.LINC01187在验证队列中的表达概况
肉瘤样ChRCC在典型的ChRCC上皮样肿瘤细胞成分中表达LINC01187，而在高级别梭形细胞成分中表达LINC01 187。8个嗜酸性粒细胞中有6个具有高的LINC01187表达(平均H值= 254;阳性病例range = 250 ~ 386，阴性2例H评分= 4)。具有嗜酸细胞特征和嗜酸细胞瘤的未分类RCCs也表现出高的LINC01 187表达(平均H评分= 377;范围= 189-400)，这提示肿瘤起源于共同肾元段。所有HOTs均表现出双重(格子)表型，只有一组细胞表达高水平的LINC01187。所有4个ChRCC活检样本均显示肿瘤内高表达LINC01187。原发性CCRCC(图4g)、CCPRCC、PRCC、tRCC、CDC、MTSCC均未检测到LINC01187RNA表达(所有32例原发性病例H评分均为0)。所有转移non-ChRCC病例,包括CCRCC(图4 h)和PRCC，以及一个转移性肉瘤样的ChRCC显示没有LINC01187表达式(表3)。FOXI1 LINC01187双RNA-ISH经典染色法证明ChRCC coexpression FOXI1和LINC01187大多数经典ChRCC肿瘤上皮细胞间细胞在邻近正常肾脏,支持认为ChRCC源于远端肾单位。
图5.FOX1和LINC01 187的RNA原位杂交
No.5
生物标志物在转移部位的表达
最后作者从5名患者收集的18个不同转移部位评估了Fox1、RHCG和LINC01187在转移性ChRCC肿瘤中的染色，发现所有样本呈弥漫强FOXI1染色，周围膜状RHCG染色，LINC01 187高表达(H评分>300)。图6显示大网膜、右腰肌、胃和腹膜后淋巴结转移的ChRCC染色。这说明了Fox1、RHCG蛋白和LINC01187转录本在空间和时间上的一致表达。
图6.生物标志物在转移性恶性肿瘤中的表达
No.6
生物标志物评估可识别具有明显分子
畸变的嗜酸性ChRCC的形态学模拟物
在评估FOXI1、RHCG和LINC01 187的表达时，发现10例嗜酸性粒细胞性ChRCC中有2例FOXI1核染色极低，而LINC01 187的表达大部分为阴性。肿瘤呈弥漫性高尔基样/分泌性RHCG染色。为评估这两例病例是否代表一种不同的疾病亚型(具有不同分子表现的嗜酸性ChRCC或类似嗜酸性ChRCC的形态)，对匹配的肿瘤和良性肾脏样本进行了全外显子组测序，以识别突变、拷贝数模式和RNAseq，以评估转录组畸变。有充分的文献证明，慢性肾病患者有反复的单拷贝丢失染色体(1、2、6、10、13和17)。根据拷贝数变异分析，指标病例是这些染色体的二倍体。两个病例都包含MTOR基因激酶域的热点错义激活突变(p.S2215Y, p.L2427Q)。从TCGA数据库中发现了另外3例最初诊断为ChRCC或PRCC的病例，测序后重新分类为混合RCC与MTOR激酶结构域突变，并且如预期的那样缺乏fox1和LINC01 187基因表达。
四、小结
本文中作者结合了TCGA、内部RCC分析和正常人肾组织scRNA-seq研究，并对来自1049个RCC标本的RNA测序数据进行综合分析，在ChRCC中鉴定出了ChRCC中FOXI1，RHCG和LINC01187。通过IHC和RNA- ISH在197例RCC病例的整个组织切片中评估了FOXI1、RHCG和LINC01187 mRNA蛋白的表达模式，包括原发性和转移性肿瘤，从而证明了FOXI1，RHCG和LINC01187是发色肾细胞癌的谱系特异性特征基因，这有助于帮助确认起源细胞并可能有助于肾肿瘤的准确分类和诊断。