低蛋白饮食可以促进啮齿动物和人类的代谢健康，而低蛋白饮食的益处可通过在饮食中特异性减少3种支链氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的水平来实现（是不是很方便！），但究竟是哪种支链氨基酸在从中作梗？3种BCAA起作用的机制又有何异同？以往的研究并有对 BCAA 的种类进行细分，也没有进行深入的机制探索。本研究证明了每种BCAA都有不同的代谢效应。首先，低异亮氨酸（Ile）饮食可以使肝脏和脂肪进行代谢重编程，来增加肝脏胰岛素敏感性和酮体生成，增加能量消耗，激活FGF21-UCP1轴。而低缬氨酸（Val）饮食可以带来相近但更温和的代谢益处，但是低亮氨酸（Leu）饮食则不会产生上述作用。再者，本研究发现，减少异亮氨酸或缬氨酸摄入可以迅速恢复饮食诱导的肥胖小鼠的代谢健康。重要的是，本研究证明了饮食中异亮氨酸水平与人体的BMI指数密切相关，并揭示了异亮氨酸是代谢健康和饮食中BCAA不良代谢反应的关键调节因子，提出了减少饮食摄入异亮氨酸作为治疗和预防肥胖和糖尿病的新方法。
1、减少异亮氨酸或缬氨酸（而非亮氨酸）可促进小鼠的代谢健康
2、低蛋白饮食的代谢益处需要减少异亮氨酸摄入
3、FGF21部分介导限制异亮氨酸摄入的代谢益处
4、人类饮食中异亮氨酸的水平与BMI指数呈正相关
肥胖在世界范围内仍是一个日益严重的健康问题，在大多数国家中的患病率正在迅速上升。肥胖也是导致糖尿病、心血管疾病、癌症和阿尔茨海默氏症等其他疾病的危险因素之一。虽然通过节食来减少热量摄入是预防这一流行病的有效解决方案之一，但通过长期限制热量摄入去减肥，对大多数人来说是很难做到的。最近，越来越多的研究证明，摄入膳食蛋白，特别是动物来源的蛋白质，会增加糖尿病、胰岛素抵抗和癌症的风险。多项研究发现，在不限制热量摄入的情况下， 低蛋白(low-protein，LP)饮食可以降低体重，减少肥胖，降低空腹血糖，甚至延长寿命，而高蛋白饮食则与之相反。
蛋白质作为人体最重要的营养素之一，对维持人体正常生理活动发挥着不可替代的作用。如果说蛋白质在人体内是“守卫军队”，那么作为其基本单位的氨基酸就是不可缺少的“冲锋士兵”。近年来，低蛋白饮食被广泛认为可以促进代谢健康，并且有文献已经发现喂食LP饮食的小鼠和人类中，血浆支链氨基酸含量特异性降低。为了进一步探究LP饮食为什么具有如此高效的作用，Dudley W. Lamming 团队推测，特定的氨基酸与LP饮食的有益作用有关 ，并将目光锁定3种支链氨基酸上。
实际上，必需氨基酸中有3种BCAA（branched-chain amino acid，支链氨基酸），包括亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）。之前普遍认为这3种BCAA有益于健康，它们可以直接为肌肉提供能量，有助于促进训练后的肌肉恢复；补充BCAA还可以通过减少肝细胞凋亡来延缓慢性肝病进展。但是，随后的研究发现BCAA与2型糖尿病病因相关联，在一定程度上损害了代谢健康（想更进一步的了解BCAA，欢迎前往Cell Metabolism五月刊 饮食干预专题——拓展阅读）。例如，在人类和啮齿动物研究中发现，血浆BCAA水平与胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病呈正相关。此外，当采取一定干预措施来改善肥胖和代谢健康时，血浆中BCAA的水平会随之降低。而本文则更为详尽地阐述了BCAA介导不良代谢效应的原因。现在流行“素食主义”在一定程度上也是利用了调节BCAA水平这一概念，因为与动物源性食物相比，植物源性食物中的必需氨基酸水平更低，因此素食主义者或者食用植物源性食物的人比肉食主义者体内的BCAA水平更低。
之前已有研究报道，特异性限制饮食中BCAA水平可以重现LP饮食的多种代谢效应，包括改善小鼠的终生代谢健康，延长年轻男性寿命等。在不限制热量的情况下，特异性限制饮食中的BCAA还可以恢复西方饮食诱导的肥胖（DIO）小鼠的代谢健康，可迅速降低体重、改善肥胖和控制血糖。在肥胖大鼠模型中，低BCAA饮食同样可以减缓脂肪积累，并保持胰岛素敏感性。总而言之，上述研究表明了饮食中BCAA在代谢健康中起关键作用。
虽然到目前为止，BCAA联合使用的生理作用已被广泛报道，但近年来关注的热点主要集中在不同种类的BCAA是否对分子过程、新陈代谢和健康具有不同的影响。例如，有研究报道这3种BCAA激活雷帕霉素复合物1(mTORC1)蛋白激酶靶点的机制是不同的。此外，尽管不同BCAA经历了相似的分解代谢过程，但每种BCAA的中间产物和最终产物是不同的。
因此，本文提出了一个假设，即每种BCAA对LP饮食的有益效果都有不同的贡献。研究发现限制Ile对于LP饮食的有益代谢作用是必不可少的，原来并不是每一个BCAA都那么“罪无可恕”的！那么，作者是如何一步步为BCAA“翻案”的呢？快跟上节奏！我们带你一起观看BCAA的“平反”之路！
减少饮食中Ile可以重现限制BCAA产生的代谢效应
为了探究饮食中BCAA对代谢健康的具体作用，作者设置了Ctrl AA饮食组 (一种由氨基酸定义的对照饮食，包含20种常见的氨基酸，可以反映天然饮食的结构，其中21%的热量来自蛋白质)，在此基础上又设置了3组氨基酸水平低于Ctrl AA组67%的饮食组，包括Low AA（低全部氨基酸）、Low BCAA (低3种支链氨基酸)和Low non-BCAA（低其他必需氨基酸）。这四种饮食都是等热量饮食，脂肪水平相同，在后两种饮食中，增加了非必需氨基酸，以保持来自氨基酸的热量恒定。结果显示，与饲喂Ctrl AA饮食的小鼠相比，饲喂Low AA或Low BCAA饮食的小鼠的葡萄糖耐量显著改善，并减缓了体重增加，而限制其他必需AA对葡萄糖耐量没有影响，且对体重的影响较小(图1A和1B)。这些结果表明BCAA对LP饮食的代谢效应具有特殊的贡献。
为了确定每种BCAA的作用，作者又设计了一系列新的饮食控制组，包括Low Leu(低亮氨酸)、Low Ile(低异亮氨酸)、Low Val(低缬氨酸)和Low BCAA，这些组别中氨基酸水平都低于Ctrl AA组的67%，在降低特定氨基酸的饮食中，增加了非必需的氨基酸含量，以保证从氨基酸中获得的卡路里不变。即所有饮食都是等热量和等脂肪含量（图1C）。与Ctrl AA饮食喂养的小鼠相比，Low Ile或Low BCAA饮食喂养3周的小鼠糖耐量得到了显著改善，Low Val饮食喂养的小鼠也表现出糖耐量改善的趋势，而Low Leu饮食喂养对小鼠的糖耐量则没有影响(图1D)。PTT（丙酮酸耐量实验，想知道具体如何操作的小朋友快去传送门）结果也与GTT一致(图1E和S1A)。接着作者测定了空腹和葡萄糖刺激下的血糖和胰岛素水平，结果发现虽然Low Ile、Low Val和Low BCAA饮食喂养的小鼠的血糖水平较低，但不同组别之间的胰岛素水平没有显著差异(图S1B)。之前的研究显示LP饮食和Low BCAA饮食都可以增加摄食量，同时促进减肥。于是作者监测了小鼠的摄食量和体重，发现Low Ile或Low BCAA饮食喂养的小鼠在体重归一化后摄食量增加了，但这两组小鼠的体重、体脂（脂肪重量和瘦肉重量）都低于Ctrl AA组小鼠(图1F和S1C-S1H)。有趣的是，作者发现在整个研究过程中，Low Ile饮食喂养的小鼠体重是最轻的，而Low Val饮食喂养的小鼠体重也增加得较少(图1F)。Low Ile或Low BCAA饮食喂养抑制了脂肪增加(图S1G)，同时Low Ile、Low Val或Low BCAA饮食喂养的小鼠的瘦肉量也明显低于Ctrl-AA组的小鼠(图S1H)。Low Leu饮食喂养的小鼠的体重、脂肪量和瘦肉量与Ctrl-AA喂养的小鼠相似，随着肥胖程度的增加，这些小鼠的体重有增加的趋势。在饲喂3个月后，Low Ile饮食喂养的小鼠的肥胖程度最低，并且比所有组小鼠都要瘦(图S1I)。作者对Low Leu饮食喂养没有改善小鼠代谢这一现象十分不解，因为之前的研究认为限制Leu是可以改善代谢健康的。于是作者猜测是否是因为Low Leu饮食中并没有充分限制Leu含量，于是设计了ExLow Leu新的饮食控制组，其中Leu的含量减少了87%，结果发现严格限制Leu时，尽管体重略有减轻，但摄食量仍然没有增加，也没有导致体脂出现显著变化(图S1J-S1M)。与Ctrl AA饮食喂养的小鼠相比，ExLow Leu饮食喂养的小鼠葡萄糖耐量仍没有改善(图S1N和S1O)。因此，当仅减少膳食中的Ile或Val时，就可以带来限制3种BCAA或膳食蛋白质时产生的有益生理作用(图1G)。尤其是减少Ile能有效控制血糖和体重，虽然降低Val的代谢效果不太明显，但始终是有益的。相反，减少Leu不仅不会产生代谢益处，甚至可能会损害代谢健康。
图 1. 饮食限制Ile或Val（而非Leu）可以改善代谢健康
图 S1. 饮食限制Ile或Val（而非Leu）可以改善代谢健康
由于减少饮食中Ile对葡萄糖和丙酮酸耐量都有显著影响，于是作者又额外喂养了一组小鼠，发现无论是饲喂Ctrl AA饮食还是Low Ile饮食，都可以观察到Low Ile饮食喂养小鼠的糖耐量显著改善(图1H)。接着，作者使用高胰岛素-正常血糖钳夹来测量胰岛素敏感性(图1I-1L)，结果显示为达到正常血糖水平，Low Ile饮食喂养小鼠的GIR（葡萄糖输注率）显著高于Ctrl AA饮食喂养小鼠(图1I和1J)。根据循环中标记葡萄糖的比例来计算全身葡萄糖摄取量和肝脏葡萄糖生成量，显示Low Ile饮食喂养显著改善了小鼠肝脏的胰岛素敏感性(图1K和1L)。
降低饮食中的Ile水平对LP饮食的代谢益处是必要的接下来，作者想要确定LP饮食是否需要降低某一种BCAA或所有3种BCAA的膳食水平来促进代谢健康。为了研究这个问题，作者进行了“added back”处理，即Low AA分别“补回”Leu（Low AA+Leu）、Ile（Low AA+Ile）和Val（Low AA+Val），或所有3种BCAA（Low AA+BCAA），使这些组别的BCAA水平恢复到Ctrl AA饮食水平，然后进行小鼠的代谢表型分析(图2A)。与之前的结果一致，体重归一化后，Low AA饮食喂养小鼠的摄食量比Ctrl AA饮食喂养的小鼠多，而补回所有3种BCAA可以恢复摄食量，但单独补回每种BCAA的效果不尽相同(图2B、S2A和S2B)。GTT实验结果表明，与Ctrl AA饮食喂养的小鼠相比，Low AA饮食喂养3周的小鼠的葡萄糖耐量显著改善。当补回Ile或所有3种BCAA后，葡萄糖耐量改善程度有所减弱；而补回Leu或Val对小鼠的糖耐量没有明显影响(图2C)。ITT实验结果显示，与Ctrl AA饮食喂养的小鼠相比，Low AA饮食喂养小鼠的胰岛素敏感性也显著改善，这一改善效果在补回Ile、Val或所有3种BCAA后有所减弱，但在补回Leu时没有受到明显影响(图2D)。PTT实验结果也显示，单独补回Ile或所有3种BCAA都可以减弱LP饮食对丙酮酸耐受性的影响，而补回Leu或Val则没有显著影响(图2E)。
尽管Low AA饮食喂养的小鼠的摄食量增加(图2B)，但在整个研究过程中，该组别的小鼠体重都明显低于Ctrl AA饮食喂养的小鼠(图2F)，且脂肪重量和瘦肉重量的增加都相应减少了(图S2C和S2D)。单独补回Ile或所有3种BCAA都会减弱Low AA饮食对体重和瘦肉重量的影响，补回所有3种BCAA则会完全阻断Low AA饮食对脂肪重量的影响(图2F、S2C和S2D)。相反，补回Val对体重或体成分没有影响，而补回Leu则会促进脂肪和瘦肉的减少(图2F、S2C和S2D)。代谢数据也显示，Low AA饮食增加了小鼠的食物消耗量、呼吸交换率(RER)和能量消耗(图S2E-S2L)。与单个BCAA对体重和体成分的影响一致，补回Ile或所有3种BCAA都削弱了Low AA饮食对能量平衡和利用的影响(图S2E-S2L)。相反，补回Val所造成的影响最小，而补回Leu反而会导致食物消耗和能量消耗增加(图S2E-S2L)。
研究还发现单独补回Ile或所有3种BCAA会阻碍Low AA饮食对代谢健康的益处，而补回Val可部分阻止Low AA饮食改善葡萄糖稳态的能力，但不影响体重和体脂。相反，补回Leu反而会增强Low AA饮食的代谢效果（图2G）。因此，降低饮食中Ile水平可以实现LP饮食的有益代谢作用，也就是说降低饮食中的Ile水平是LP饮食促进代谢健康所必需的。
低Ile饮食中产生的代谢效应不是由肝脏mTORC1和GCN2介导的实际上，最近研究发现Ile、Val和Leu一样都是mTORC1的激动剂。但令人惊讶的是，Low AA和Low Ile饮食喂养并没有改变肝脏中mTORC1的下游S6和其底物4EBP1的磷酸化水平(图3A)。于是作者进一步探究肝脏mTORC1是否直接与Low Ile饮食的代谢效应有关。
作者发现当用Ctrl AA或Low Ile饮食喂养L-TSC1 KO（肝脏特异性敲除mTORC1的负调控因子TSC1）小鼠及WT小鼠时，Low Ile饮食喂养的L-TSC1 KO小鼠及WT小鼠的葡萄糖耐量都能得到改善(图3B-C)。PTT实验结果显示，通过Low Ile饮食喂养，L-TSC1 KO和WT小鼠的胰岛素敏感性也有一定改善(图S3B)。而且WT和L-TSC1 KO小鼠在饲喂Low Ile饮食后，其体重、体脂及代谢表型相似(图3D，S3C-S3E)，这说明Low Ile饮食产生的代谢效应不是由肝脏中mTORC1所介导的。
于是作者将目光投向GCN2(general control nonderepressible 2，主要的氨基酸敏感激酶，它由不带电荷的tRNAs激活，是适应缺乏氨基酸的饮食所必需的)。首先，观察到饲喂Low AA饮食的小鼠的GCN2底物eIF2a磷酸化水平增加，下游转录因子ATF4表达也增加，但在Low Ile饮食喂养的小鼠中没有观察到这些变化(图3E)。因此，作者决定进一步研究肝脏中GCN2信号是否与Low Ile饮食的代谢效应有关，于是分别给肝脏GCN2敲除(L-GCN2 KO)小鼠和WT小鼠饲喂Ctrl AA或Low Ile饮食(图3F)。由于GCN2已被证明对LP饮食的初期适应是至关重要的，因此作者分别在喂养12天后(图S3F)和3周后(图3G)进行GTT实验，发现Low Ile饮食改善了WT和L-GCN2 KO小鼠的葡萄糖耐量，两组小鼠的体重和体脂都有所降低(图S3G-S3I)。综上，作者认为Low Ile饮食并不是通过激活肝脏GCN2来促进代谢健康的(图3H)。
图3.限制Ile的代谢效应与肝脏mTORC1和GCN2活性无关
图 S3.限制Ile的代谢效应与肝脏mTORC1和GCN2活性无关氨基酸是mTORC1的关键调控因子，mTORC1在营养物质充分时，包括在富含生长因子、氨基酸和葡萄糖等条件下（如饱食后），能够被激活，进而促进一系列合成代谢相关途径的活化。不同的氨基酸既可以通过各自的受体，活化Rags（Rags亚家族是Ras小G蛋白家族的一员，可以控制mTORC1在溶酶体表面的定位，以响应营养水平的变化），也可以直接通过相对应的氨酰tRNA合成酶，对 Rags进行相应的修饰，从而激活mTORC1。在氨基酸水平上升时，Rags抑制分子如GATOR1能被降解，从而引起Rags的激活。此外， SLC38A9被认为是精氨酸传感器，是一种与氨基酸转运体同源的溶酶体跨膜蛋白，也是mTORC1通路的正调节器。
Gcn2是一个主要的氨基酸敏感激酶，由不带电荷的tRNAs激活，是适应缺乏氨基酸饮食必不可少的酶，激活的GCN2激酶通过磷酸化真核启动因子2α(eIF2α)，可以刺激合成氨基酸相关基因的表达。有研究报道，亮氨酸的减少可以通过激活GCN2和降低mTOR/ S6K1信号来改善肝脏胰岛素敏感性。此外还发现在缺乏亮氨酸的情况下，肝脏中脂肪生成基因的表达和脂肪酸合酶的活性受到抑制，脂肪组织中的脂质存储被调动。Gcn2缺陷小鼠也会发生肝脂肪变性并表现出脂质动员减少。因此，研究发现GCN2在亮氨酸限制过程中除了调节氨基酸代谢外，还具有调节脂质代谢的功能。GCN2作为氨基酸传感器，也可以将蛋白质限制与FGF21的诱导联系起来。
参考文献
【1】Wolfson RL, et al. Cell Metab. 2017 Aug 1;26(2):301-309.
【2】Guo F, et al. Cell Metab. 2007 Feb;5(2):103-14.
降低饮食中Ile水平使肝脏发生代谢重编程
接下来，作者对Ctrl AA或Low Ile饮食喂养3周的小鼠的肝脏进行转录谱和代谢组学分析，并观察到Low Ile饮食对肝脏的基因表达产生了显著影响。在禁食（fast）小鼠和重新进食（refed）小鼠中分别有184个基因和55个基因发生了显著变化(图4A；表S3)。通过靶向代谢组学发现，在fast小鼠和refed小鼠中分别有6种和24种代谢物显著变化(图4B)。
作者利用Metaboanalyst发现Low Ile饮食造成了包括碳水化合物代谢和糖酵解，BCAA降解和脂肪酸的生物合成这几个中心代谢过程发生了改变(图4C)。在fast小鼠中，观察到Low Ile饮食增加了糖酵解基因表达，乙酰辅酶A和TCA循环中间产物琥珀酸和α-酮戊二酸的含量(图4D)。此外，还观察到其他2种BCAA（Leu和Val）水平降低，其分解中间产物HMG-CoA (β-羟基β-甲基戊二酰辅酶A)和丙酰辅酶A水平升高(图4E)。同时Low Ile饮食喂养的小鼠血液中BCAA（Ile也没有降低）水平没有降低，而肝脏中Leu和Val的水平呈上升趋势，这反映BCAA分解代谢发生了改变 (图S4B；表S3)。此外，还观察到禁食和进食状态下肝细胞BHB (羟基丁酸)水平升高，这表明可能是因为乙酰乙酸盐和乙酰辅酶A增加导致酮类生成增加(图4B)。同时，脂肪酸合成酶 (FASN)的表达显著上调，提示脂肪生成可能增加。因此，上述结果表明，摄入Low Ile饮食后，肝脏代谢发生了极大变化。
为了深入探究响应Low Ile饮食代谢效应的潜在转录调控因子，作者利用Magic分析工具鉴定了13个显著富集的转录因子（ENCODE记录了在多种生长和维持条件下，117个人类细胞系中684个TFs和辅助因子的2314条ChIP-seq轨迹。Magic分析工具就是使用ENCODE ChIP-seq数据寻找基因体和基因列表中的TFs和辅助因子的统计富集）(图S4C)。有趣的是，作者发现了与肝脏胰岛素敏感性和酮体生成密切相关的转录因子FOXA2，与MAGIC预测结果一致，在Low Ile饮食喂养的小鼠肝脏中核FOXA2水平显著增加(图4F)。（小编注：FOXA2活性受定位调节，细胞质FOXA2是不活跃的，而细胞核FOXA2是活跃的。）
图 4. 限制ILe可重编程肝脏代谢
减少饮食中Ile可诱导FGF21-UCP1轴并促进能量消耗
转录图谱分析显示在Low Ile饮食喂养下，FOXA2的靶基因上调最多，前50个上调基因中包含FGF21（用转录图谱分析得出）(图4A和S4D)。FGF21是一种促进肝脏胰岛素敏感性和调节能量稳态的激素，可由多种应激诱导，包括LP饮食。虽然前期工作表明，在Low BCAA饮食喂养的小鼠的血浆中FGF21表达没有增加，但Low BCAA饮食会显著诱导DIO小鼠FGF21的表达，且在进行Low BCAA饮食的糖尿病人中也能观察到FGF21表达升高。FGF21可以促进肝酮体生成，本研究中也发现Low Ile饮食喂养的小鼠体内BHB水平升高(图4B；表S3)。
肝脏中脂肪酸通过β-氧化生成大量的乙酰辅酶A，其中一部分乙酰辅酶A可以生成酮体（包括β-羟丁酸（β-OHB）、乙酰乙酸（AcAc）以及丙酮）。酮体能够作为生物的替代燃料能源，其虽然是在肝脏中合成，但肝脏中缺乏利用酮体的酶。因此酮体需要运输到肝外组织中进行代谢。酮类代谢在心力衰竭、肥胖、NAFLD/NASH、2型糖尿病和癌症中方面都有益处。
在氧化应激模型中，可以通过酮体代谢重编程来维持不同的细胞信号、氧化还原电位等。在缺乏营养时，酮体的新陈代谢可以为大脑提供能量，其能够降低神经元的细胞损伤和死亡。另一方面，酮体还具有抗炎作用，长期缺乏营养时可以减少炎症。
参考文献
【1】Puchalska P,et al. Cell Metab. 2017 Feb 7;25(2):262-284.
在Low Ile饮食喂养小鼠的肝脏、iWAT (腹股沟白色脂肪组织)和骨骼肌中均观察到FGF21 基因表达增加(图5A)。与此一致的是，Low Ile饮食喂养的小鼠血浆中FGF21水平也升高了(图5B)，而Low Leu或Low Val饮食则没有出现这一现象(图S4E)。与Low Ile饮食通过FGF21诱导酮生成的模型一致，只有Low Ile和Low BCAA饮食喂养的小鼠血液中BHB水平升高了(图S4F)。
由于FGF21可以通过促进WAT棕色化来推动能量消耗，因此在Low Ile、Low Val或Low BCAA饮食喂养的小鼠iWAT中(图5C，图S4G)，都观察到多房状米色脂肪细胞。相反，在Low Leu饮食喂养的小鼠iWAT中或在任何饮食（on any diet）喂养的小鼠性腺WAT中都没有观察到棕色化现象(图S4G)。与此一致的是，作者还发现Ucp1和其他2个关键产热基因（Cidea和Elovl3）的表达增加(图5D)。由于iWAT米色化的特征是诱导脂质分解和脂肪生成的无效循环【小编注：无效循环也称之底物循环（substrate cycle）是指一对催化两个途径的中间代谢物之间循环的方向相反、代谢上不可逆的反应】，因此作者探究了几个关键的脂生成基因，包括Acc1和Acc2 (乙酰辅酶A羧化酶1和2)和FASN，以及脂肪分解关键基因Atgl (脂肪甘油三酯脂酶)和Lipe (激素敏感脂酶)的表达，发现在Low Ile饮食喂养的小鼠中均出现表达上调(图5E)。
接下来作者检测了分别减少每一种BCAA或减少所有3种BCAA的饮食喂养小鼠的能量平衡，并评估了能量利用率(图5F和S4H-S4O)，结果发现饲喂Low Ile或Low Val饮食喂养的小鼠的活动量虽然没有差异，但食物消耗量都有一定增加(图S4H-S4J和S4O)。体重归一化后，Low Ile、Low Val或Low BCAA饮食喂养的小鼠的能量消耗增加(图5F和S4L)。在Low Val或Low BCAA饮食喂养的小鼠中，反映底物利用率的RER在夜间增加，这表明碳水化合物的利用率增加了(图S4N)。
RER(respiratory exchange rate)是生成的二氧化碳(CO2)与消耗的氧气(O2)的比率，可以表示在稳定状态下供能物质的利用情况。随着运动时间和强度的增加，RER会受到我们身体产生的酸性代谢物（例如乳酸盐）的影响，而无法体现供能物质的利用情况。
为了探究FGF21是否介导了Low Ile饮食的代谢效果，作者给WT和全身FGF21敲除 (FGF21 KO) 小鼠饲喂Ctrl AA或Low Ile饮食并监测代谢变化，结果显示Low Ile饮食喂养的WT小鼠的食物消耗量增加，而FGF21 KO小鼠没有增加(图5G、S5A和S5B)。但是，在Low Ile饮食喂养下，WT和FGF21 KO小鼠的体重和体脂变化相似(图S5C)。（讨论中提到，需要进一步的研究来充分确定膳食Ile调节FGF21表达和程序新陈代谢的机制，并确定FGF21在大脑中的作用是否介导了膳食ILE对能量平衡的影响）。
接下来，作者利用代谢笼监测并分析Low Ile饮食是如何改变WT和FGF21 KO小鼠的能量平衡(图5H和S5D-S5F)。结果显示，WT小鼠的能量消耗显著增加，而在FGF21 KO小鼠中显著减弱，不论是在光照还是黑暗周期，WT或KO小鼠分别饲喂不同饮食或相同饮食，都存在显著差异(图5H)。然而，WT和KO小鼠同时饲喂Low Ile饮食时，糖耐量改善能力没有差异(图S5G)。因此，可以得知Low Ile饮食的部分(但不是全部)代谢效应是依赖于FGF21。
鉴于Low AA和Low Ile饮食喂养的小鼠的肥胖率较低，于是作者利用在热中性条件下饲养的小鼠进行冷刺激实验，结果发现热中性条件下Low Ile和Low AA饮食对代谢的影响和室温条件下几乎相同，并且这两种饮食都改善了葡萄糖耐量和体脂(图5I、5J、S5H和S5I)。因此，小鼠所处的环境温度并不影响Ile饮食的整体代谢反应。
图 5.减少饮食中的Ile诱导FGF21-UCP1轴，促进能量消耗
图 S5.减少饮食中的Ile诱导FGF21-UCP1轴，促进能量消耗
在不健康的西方饮食的背景下，限制饮食中Ile益处更大
先前的研究发现，在DIO小鼠持续摄入高脂肪、高糖的WD（西方饮食）情况下，减少饮食中的BCAA仍可以恢复DIO小鼠的代谢健康。于是作者研究了在西方饮食饮食喂养12周的小鼠中降低单个BCAA水平对代谢的影响(图6A)。
WD喂养12周后，再饲喂Low Ile、Low Val或Low BCAA饮食的小鼠摄食量高于WD喂养12周再喂养Ctrl AA饮食的小鼠(图6B、S6A和S6B)。虽然吃得更多，但饲喂这些饮食的小鼠很快就减掉了多余的体重和脂肪，且瘦肉的变化较小，总体是肥胖减轻的(图6C、6D、S6C和S6D)。与从未饲喂过WD的对照组（Ctrl AA）相比，WD Low Ile饮食喂养的小鼠的体重和肥胖的减少最为明显。另外，与饲喂WD Ctrl AA饮食的小鼠相比，饲喂WD Low Leu饮食的小鼠的体重和体脂没有区别(图6C、6D、S6C和S6D)。
与Ctrl AA饮食喂养的小鼠相比，WD Ctrl AA和WD Low Leu饮食喂养的小鼠表现出葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。然而，WD Low Ile、WD Low Val或WD Low BCAA饮食喂养的小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性显著改善(图6E和S6E)，并在丙氨酸耐量试验中对肝糖异生的抑制作用显著改善(图S6F)。总体而言，作者发现，减少饮食中的Ile、Val或所有3种BCAA都可以恢复饲喂WD的DIO小鼠的代谢健康，而降低Leu水平则不会带来有益影响(图6F)。
然后作者使用高胰岛素-正常血糖钳夹来检测WD Ctrl AA和WD Low Ile饮食喂养的小鼠的胰岛素敏感性(图6G-6J和S6G-S6I)，结果发现WD Low Ile饮食喂养的小鼠所需的GIR明显高于对照组小鼠(图6G)。在WD Low Ile饮食喂养的小鼠中，几个关键代谢组织，包括BAT (棕色脂肪组织)、心脏、iWAT和骨骼肌中的葡萄糖摄取率显著较高(图6H、6I、S6G和S6H)，同时肝脏胰岛素敏感性显著改善(图6J和S6I)。
WD Low Ile、WD Low Val或WD Low BCAA饮食在体脂和血糖控制方面的积极作用往往伴随着能量消耗的增加(图6K、S6J和S6K)。尽管WD Low Ile、WD Low Val或WD Low BCAA饮食喂养的小鼠的食物消耗量和RER更高(图S6L-S60)，但除了WD Low Ile喂养的小鼠在白天时活动量有显著增加外，其余小鼠的自主活动量没有显著变化(图S6P)。最后，由于WD喂养会导致肝脏脂肪变性，于是作者检测了小鼠肝脏中的脂质积聚。虽然WD Ctrl AA和WD Low Leu饮食喂养的小鼠肝脏中的脂类显著积累，但WD Low Ile、WD Low Val或WD Low BCAA饮食喂养的小鼠肝脏脂质沉积减少，脂滴变小，与Ctrl AA饮食喂养的小鼠的表型相似(图6L、6M和S6Q)。
图 6.饮食限制Ile或Val可以改善DIO小鼠的代谢健康
图 S6.饮食限制Ile或Val可以改善DIO小鼠的代谢健康
Ile摄入增加削弱了LP饮食对肥胖的有益影响
由于在瘦小鼠中，需要减少饮食中的Ile才能发挥LP饮食的代谢益处，因此作者猜测在DIO小鼠中可能有同样的效果。于是又采用和前面类似的“add back”进行回补试验，设置了WD Low AA+ Leu、WD Low AA+ Ile、Low AA+ Val以及WD Low AA+ BCAA饮食组别。
与WD Low AA饮食喂养的小鼠相比，补回了任一种或所有3种BCAA都显著抑制了小鼠的食物消耗量(图7B和S7B)。与WD Ctrl AA喂养的小鼠相比，WD Low AA喂养的小鼠的体重体脂都有所降低，而补回Ile或BCAA会减弱Low AA饮食对体重和体脂的影响(图7C-7E和S7C-S7E)。与之前的研究结果一致，补回Val对体重体脂的影响很小，而补回Leu则起到了相反效果(图S7F-S7H)。
正如预期的那样，WD Low AA饮食改善了糖耐量，补回Ile或BCAA都削弱了这种效应，而补回Leu或Val则不能(图7F和S7I)。最后，ITT结果也同样显示了WD Low AA饮食可以改善胰岛素敏感性，补回Ile或Leu都削弱了这种效应(图S7J)。
总体而言，作者发现，降低饮食中Ile水平是实现LP饮食产生代谢益处所必须的，而饮食中补回Ile，而不是Val或Leu，就可以使WD Low AA喂养的小鼠与WD Ctrl AA饮食喂养的小鼠出现相似的代谢表型(图7G)。
图 7.Ile摄入量的增加可减弱LP对肥胖的有益影响，并与人类高BMI有关
图 S7. Ile摄入量的增加可减弱LP对肥胖的有益影响，并与人类高BMI有关
Ile摄入量增加与人类较高的BMI相关
接下来，作者探究了饮食中的Ile水平是否与人体代谢健康有关。于是，在一个随机选择的、基于人群的横断面成人人群（cross-sectional population-based sample of adults）(>18岁)中，测定了Ile的摄入量(相对于总蛋白)和BMI(kg/m2)之间的关系。结果发现，饮食中摄入的Ile相对于总蛋白质每增加一个百分点（例如从蛋白质的4%到5%），就与BMI增加2.46个单位显著相关(图7H；表S6)。这些结果与动物研究结果一致，这表明在一般人群样本中，摄入含有较高比例Ile的蛋白质会增加BMI，而Val或Leu的摄入量与BMI没有明显的相关性(表S6)。综上所述，这些结果表明膳食蛋白质，尤其是膳食蛋白质中Ile的比例，可能是调节人体代谢健康的一个重要因素。
表 S6: Leu、ILe和Val摄入与人群样本BMI之间的关系
本研究发现，限制Val虽然可以改善新陈代谢，但对于实现LP饮食的有益效果来说并不是必需的。相反，作者发现减少饮食中的Ile可以进行肝脏代谢重编程，诱导胰岛素增敏和能量平衡激素FGF21的表达，并激活FGF21-UCP1轴，促进脂肪组织形成和能量消耗。并且，通过减少饮食中的Ile或Val的方式恢复的代谢健康，可以让DIO小鼠继续“无所顾忌”的食用不健康的西方饮食。令人惊讶的是，限制Leu并没有这种效果， Low Leu饮食喂养的小鼠的体重体脂，葡萄糖耐量、丙酮酸耐受性等都没有得到显著改善，甚至可能会损害代谢健康。值得注意的是，作者发现膳食蛋白质的摄入与人体BMI的增加有关。综上所述，这篇文章发现膳食Ile是调节代谢健康和膳食中BCAA的关键因子，降低膳食中Ile水平可能是未来促进和恢复我们体内代谢健康的一种可行性方式。
