编译：牙牙更健康，编辑：Tracy、江舜尧。
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导读
肾细胞癌(RCC)约占成人恶性肿瘤的4%，其由不同的亚型组成，具有不同的组织学和分子遗传学特征，主要有透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、乳头状肾细胞癌(pRCC)和嫌色肾细胞癌(chRCC)。目前，chRCC是否适应营养不良微环境的代谢状态和机制仍有待研究。本研究利用蛋白质组、转录组和代谢组分析、荧光成像和全外显子组测序(WES)对chRCC进行了全面的研究，确定了糖异生、氨基酸代谢和内吞作用的主要代谢重编程。在chRCC中，全外显子组测序显示，TP53突变与PLCG2的表达和内吞作用的激活无关，PLCG2/IP3/Ca2+/PKC通路在细胞内吞激活中起调节作用，从而促进chRCC细胞的增殖和存活。本研究的发现可能为慢性肾细胞癌潜在治疗方法的开发提供新的视角。
原名：Endocytosis-mediated replenishment of amino acids favors cancer cell proliferation and survival in chromophobe renal cell carcinoma译名：内吞介导的氨基酸补充促进嫌色肾癌的癌细胞增殖和存活
1. 慢性肾细胞癌蛋白质组和代谢组谱的研究
实验采用了两种系统组学方法，我们基于蛋白质组和代谢组图谱，在9个chRCC和邻近的健康肾组织样本中进行了全面的chRCC代谢特征分析(图1A，1B)。在慢性肾细胞癌样本和邻近的健康肾组织中，我们共鉴定出26839个多肽和3575个蛋白质，误发率(FDR)均为1%。在不同样本之间，慢性肾细胞癌的皮尔逊相关系数在0.659到0.921之间，肾组织中的皮尔逊相关系数在0.770到0.955之间。主成分分析(PCA)显示，第一个成分虽然两个异常值，但区分了慢性肾细胞癌标本和肾组织，表明肿瘤样本间的高度变异性，很可能是由于微环境条件的差异或肿瘤的异质性导致的。然后我们采用了本杰米尼-霍希伯格(BH)校正的t检验(FDR<0.05)进行多重检验，以确定chRCC和对照之间存在显著差异的蛋白质，总共鉴定出了983个显著调控的蛋白质，其中390个蛋白质在chRCC中上调，593个蛋白质在chRCC中下调(图1C)。在这些显著变化的蛋白质中，果糖-1，6-二磷酸酶(FBP1)在肿瘤中减少了16倍以上，它被证明是抑制ccRCC进展的。磷脂酶C-γ2(PLCG2)在chRCC中表达增加59倍以上，因其高转录水平而被认为是chRCC的潜在生物标志物。因此，本研究的蛋白质组学分析可以验证RCC的已知分子特征，并作为后续计算分析的源数据集。GSEA揭示了几个显著调控慢性肾细胞癌与健康组织的KEGG途径(图1D)(p≤0.01和fdr≤0.05)。与正常组织相比，慢性肾细胞癌上调的途径包括蛋白酶体、泛素介导的蛋白降解、溶酶体和吞噬作用。相反，参与能量供应链和营养动态平衡的途径，如脂质代谢、谷胱甘肽代谢、过氧化物酶体、糖酵解和糖异生以及氨基酸代谢，在ChRCC中被显著下调(图1D)。我们进行了一组针对366种代谢物的代谢物谱分析。代谢物鉴定基于三个严格的标准来排除假阳性结果：(1)正确的保留时间，(2)最多三次多反应监测(MRM)转变，以及(3)匹配的纯代谢物MRM离子峰比作为参考。使用这一策略，总共有144种代谢物被鉴定和量化(图1E)。经两样本t检验和BH(FDR为0.05)校正的多重检验统计分析表明，与肾组织相比，chRCC中9种代谢物显著增加(p值<0.01)，19种代谢物显著减少(图1E)。前三个显著上调的代谢物均与谷胱甘肽代谢有关（包括氧化型和还原型谷胱甘肽和谷胱甘肽前体γ-谷氨酰半胱氨酸；图1E），与先前在chRCC中进行的研究一致。有研究在其他RCC亚型中也报道了类似的模式，包括ccRCC，pRCC和肾癌细胞瘤。因此，以增加谷胱甘肽作为肾癌的标志，靶向谷胱甘肽代谢可以作为一种特定的治疗策略。
（A）蛋白质组学工作流程涉及肿瘤和肾脏样品的组织裂解，然后用胰蛋白酶进行蛋白质消化，肽分离，LC-MS /MS分析和无标记定量.（B）代谢组工作流程涉及肿瘤和肾脏样品的组织裂解以及代谢物提取，然后使用目标LC-MS /MS方法进行数据采集并确定峰面积的相对定量。（C）chRCC与肾脏组织（n = 9）的log2丰度比对蛋白质组-log10（p值）的火山图。共有390种蛋白质显著上调，以红色显示。593种蛋白质显著下调，以蓝色显示。N.S.表示无显著性差异。（D）chRCC与肾脏对照的蛋白质途径分析。表明chRCC中KEGG途径显著（p≤0.01，FDR≤0.15）富集（红色）和减少（蓝色）。灰线连接重叠的路径。虚线画出了类似的路径，例如氨基酸，脂质和碳水化合物代谢减少以及蛋白质降解增加。（E）chRCC与肾脏组织的队列（n = 9）中144种代谢物的倍数变化分布。显著（FDR<0.01）的代谢物上调和下调分别以红色和蓝色显示。 N.S.表示无显著性差异。
2. 糖异生在chRCC中完全停止
chRCC中的KEGG途径“糖酵解和糖异生”显著减少（图1D）。该途径描述了两种相反的代谢功能：从葡萄糖生成丙酮酸，反之亦然。因此，我们检查了该代谢途径的细节，结果显示所有糖酵解酶均未改变或略有增加，这表明chRCC中的糖酵解增加（图2A）。chRCC中所有仅涉及糖异生的酶均显著降低，包括丙酮酸羧化酶（PC，124倍），磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（PCK1，96倍），PCK2（996倍），醛缩酶B（ALDOB，922倍），和果糖1,6-双磷酸酶1（FBP1，29倍；图2A）。chRCC中增加的两个醛缩酶同工型A（ALDOA）和C（ALDOC）对果糖1,6-双磷酸酯（F-1,6-BP）具有高亲和力以促进糖酵解，而大大降低异构体B对F-1,6-BP的亲和力，因此促进了F-1,6-BP从3-磷酸甘油醛到F-1,6-BP的转化。而且，F-1,6-BP在PC中的降低，是丙酮酸进入TCA循环的主要入口，表明肿瘤依赖乳酸发酵，同时chRCC中的乳酸脱氢酶A（LDHA，3倍）蛋白水平显著提高也证明了这一点。从TCGA中提取的chRCC转录组数据分析显示出相似的调节作用，参与糖异生的所有转录本均大量消耗（图2B）。停滞的糖异生可以被认为是在该肿瘤中观察到的最相关的代谢变化之一，也是chRCC的标志。先前发现chRCC的氧化磷酸化能力降低，同时糖酵解蛋白的丰度更高，这是Warburg效应的典型现象。缺氧诱导因子（HIF）是一种主要的转录调节因子，可以调节各种肿瘤类型和正常组织中的Warburg效应。在ccRCC中，由于VHL功能丧失，HIF会积累并增强其靶基因的转录，这些靶基因与关键的致癌途径有关，比如葡萄糖摄取，糖酵解（例如葡萄糖转运蛋白，GLUT），细胞增殖（例如表皮生长因子受体，EGFR；转化生长因子，TGF）和血管生成（例如血管内皮）生长因子（VEGF）。尽管缺乏HIF的已知遗传变异，但我们想知道在chRCC的背景下HIF是否参与糖酵解和糖异生的调控，分析和比较ccRCC和chRCC的转录组数据（均来自TCGA的数据集）表明，相对于正常肾脏，ccRCC中的所有HIF靶标均表达上调（图2C）。相反，这些基因在chRCC中几乎全部被下调，除了VEGFA，其在chRCC中的表达低于在ccRCC中的表达（图2C）。这些结果表明HIF不参与chRCC的葡萄糖代谢。综上所述，chRCC破坏了葡萄糖代谢，其中糖酵解略微上调，而糖异生完全停止。与ccRCC中不同，HIF不参与chRCC中这些更改的调节。
（A）chRCC中糖酵解和糖异生代谢途径的蛋白质丰度。在chRCC和肾脏组织之间显示Log2倍变化；上调的蛋白质以红色显示，下调的蛋白质以蓝色显示。符号*表示蛋白质的调控程度很高。（B）chRCC肿瘤（n = 66）和对照（n = 25）之间糖异生基因的转录本（来自TCGA）。 FBP1，果糖-1，6-双磷酸酶1； ALDOB，果糖二磷酸醛缩酶B； PCK1，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，胞质； PCK2，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，线粒体； PC，丙酮酸羧化酶。通过RNA-Seq期望最大化来计算数据。（C）chRCC（n = 66）和ccRCC（n=533）与正常对照组中主要HIF靶标的倍数变化（log2）。通过学生t检验，（B）和（C）中的P值是*** P<0.001。
3. chRCC特征代谢中间体的消耗和涉及氨基酸代谢的途径
在蛋白质组水平上，我们发现十个不同的参与氨基酸代谢的途径在chRCC中显著下调（图1D）。总的来说，参与氨基酸代谢的114种蛋白质中有95种显示丰度降低（平均22倍；图3A）；此外，与脂肪酸代谢相关的六个途径显著下调（图1D），包括脂肪酸代谢和过氧化物酶体（脂肪酸氧化的主要细胞器）。参与氨基酸代谢的代谢产物是chRCC中最缺乏的代谢产物，与氨基酸途径中减少的蛋白质丰度相匹配（图3B-3G），它们包括胍基乙酸（多种氨基酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，精氨酸和脯氨酸的代谢，16倍），尿酸（色氨酸代谢，16倍），吲哚乙酸（色氨酸中间体，51倍），脲基丙酸（β -丙氨酸代谢（6倍），马尿酸（甘氨酸代谢22倍），水杨酸（甘氨酸代谢26倍）和乙酰谷氨酰胺（谷氨酰胺代谢5倍）（图3B-3G）。有所有氨基酸要么不变，要么可以忽略不计，唯一的例外是甘氨酸，它在chRCC中没有显著降低。结果表明，在chRCC中，所有产生氨基酸的代谢过程均显著减少，但是令人惊讶的是，标准氨基酸的量保持不变。
（A）创建了蛋白质-蛋白质相互作用网络以阐明chRCC中整个氨基酸代谢途径的调控。结节的颜色对应于chRCC和健康肾脏组织的蛋白质表达倍数变化。红色表示在chRCC中上调，蓝色表示下调。结节的大小对应于蛋白质表达的绝对倍数变化。（B-G）显示了针对肾脏组织和chRCC的六个选定氨基酸中间体的相对丰度。（B）胍基乙酸。（C）尿酸。（D）吲哚乙酸。（E）马尿酸。（F）水杨酸。（G）乙酰谷氨酰胺。通过学生t检验，（B）至（G）中的P值分别为** P<0.01，*** P <0.001。
4. chRCC细胞通过胞吞作用以胞外大分子为食，以维持增殖和存活
在营养供应方面，chRCC缺乏血管支持，并且其葡萄糖摄取量显著低于其他RCC类型。此外，分析表明，chRCC中的氨基酸代谢显著下调（图1D，图3），但所有氨基酸水平均保持不变。我们假设chRCC细胞可以优先消耗内源氨基酸和分解外部大分子作为氨基酸的来源；实际结果表明，在chRCC中，与胞吞作用有关的一种途径（FcγR介导的吞噬作用）和三种蛋白质降解途径（溶酶体，泛素介导的蛋白水解和蛋白酶体）被显著上调（图1D）。V型质子ATPase和Rab GTPases在内体形成，成熟，运输和与溶酶体融合中起重要作用，相对于肾脏组织，这些蛋白质大多数在chRCC中显著上调（图4A）。而一些异常蛋白质在肾脏组织中的表达高于chRCC肿瘤（图4A），其中包括三种V型质子ATPase（ATP6V1B2，ATP6V0A1，ATP6V1C1）和两种Rab GTPases（RAB29，RAB5C）。两种溶酶体标记，溶酶体相关的膜蛋白1和2（LAMP1和LAMP2），分别上调了3倍和7倍（图4A）。这些代谢变化表明，chRCC细胞优先利用细胞外生物量募集和蛋白质降解来获得chRCC中的质量和营养。为了进一步研究溶酶体蛋白的丰度增加与chRCC中酶活性的增加是否相关，我们测量了两种溶酶体酶（己糖胺酶A和B）的活性。这些酶参与了神经节苷脂的分解，并且在chRCC中显著增加（图4B-4C）。接下来，我们探讨大分子补充是否能增强chRCC细胞的生长速率，而这又是否可以通过内吞相关途径中蛋白质丰度的变化反映出来。因此，我们评估了chRCC衍生的在氨基酸和牛血清白蛋白浓度下的UOK276和正常肾细胞的增殖情况。总体而言，当补充了2.5％BSA并且在所有氨基酸浓度下，UOK276和HK-2细胞的生长速度都显著加快，而当补充了基本必需培养基中10％的氨基酸水平时，只有UOK276细胞生长得同样好（图4D-4E），即使在低氨基酸浓度（1％）和添加2.5％BSA的情况下，UOK276细胞也能正常增殖，而HK-2细胞在相同条件下会明显降低其生长速率，该结果表明UOK276细胞具有利用BSA补偿氨基缺乏的更高潜力。补充了1％氨基酸的UOK276细胞蛋白质组分析以及与完全培养基相比添加了2.5％BSA的蛋白质组分析显示，内吞作用（转铁蛋白内吞和再循环，Reactome）和溶酶体（KEGG）途径显著增加（图4F）。前述条件之间的酶活性测量和UOK276细胞的溶酶体己糖胺酶A和B的比较进一步证实，外部大分子通过内吞作用触发了内化和降解途径以酶促方式分解大分子（图4G-4H），表明chRCC细胞营养不良。为了全面验证chRCC细胞中内吞率的增加，我们应用了基于荧光定量图像的检测方法，结果显示随着时间的推移，DOK-Red BSA在UOK276细胞中积累，提供了巨胞饮作用是chRCC细胞摄取大分子作为营养源的既定过程的证据。此外，我们将chRCC细胞（UOK276）中DQ-Red BSA的内吞摄取与ccRCC细胞（786-O）和正常人肾（HK2）细胞进行了比较，以KRAS WT（BxPC-3）和KRASG12C突变体（MIA PaCa-2，促进巨胞饮作用）胰腺癌细胞分别用作阴性和阳性对照，与KRASWT和HK2对照细胞相比，chRCC，ccRCC和KRAS突变细胞显示出明显更高的DQ-Red BSA内吞摄取（图4I-K）。
5. PLCG2 /IP3/Ca2+/PKC途径的药物抑制ChRCC细胞的内吞作用
相对于正常肾脏组织，我们发现chRCC中磷脂酶Cγ2（PLCG2）的蛋白质和RNA显著上调（图5A）。为了研究PLCG2及其下游IP3/Ca2+/PKC途径在胞吞作用中的作用，我们开发了一种LC-MS/MS方法，使用同位素示踪剂定量通过胞吞作用清除蛋白质（图5B）。首先，我们将chRCC细胞在含有13C和15N标记氨基酸（13C15NAA）的培养基中培养10代，以完全标记所有细胞内氨基酸和蛋白质。然后，将2.5％未标记的BSA添加到同位素标记的介质中，并监测衍生的未标记氨基酸的内源BSA的量。通过测量培养基和细胞内未标记的必需氨基酸的量，我们评估了不同条件下的胞吞水平。5-（N-乙基-N-异丙基）-阿米洛利（EIPA，一种广泛使用的内吞抑制剂），U73122（PLCG的一般抑制剂），2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯（2-APB，一种IP3R拮抗剂），BAPTA-AM（细胞膜可渗透的Ca2 +螯合剂）和双吲哚基马来酰亚胺I（BI，PKC抑制剂）被应用于UOK276细胞，而亮氨酸和赖氨酸是BSA中最丰富的两种必需氨基酸，在使用上述抑制剂处理的细胞时均显著降低（图5C-5D），所有其他必需氨基酸均显示出相同的趋势。为了进一步验证PLCG2途径在胞吞激活中的作用，我们研究了PLCG2途径抑制剂对UOK276细胞中DQ-Red BSA摄取的抑制作用，与必需氨基酸水平的降低结果相似，在UOK276细胞中DQ-Red BSA的内吞摄取移植后明显降低（图5E-5F）。综上所述，这些结果表明PLCG/IP3/ Ca2+/PKC途径参与了chRCC细胞内吞作用的激活。
图5 化学抑制PLCG2/IP3/Ca2+/PKC途径可抑制chRCC细胞内吞（A）Log2蛋白强度和RNA RSEM图显示，相对于正常肾脏组织，chRCC中PLCG2的蛋白和RNA丰度显著增加。（B）该图显示了使用同位素示踪采用质谱分析通过内吞作用量化蛋白质清除的情况。（C-D）应用10 µM EIPA，30 µM U73122、100 µM 2-APB，30 µM BAPTA-AM和3 µM BI后，未标记（BSA衍生）的亮氨酸（C）和赖氨酸（D）的峰面积图。（E）定量分析用10 µM EIPA，30 µM U73122、100 µM 2-APB，30 µM BAPTA-AM和3 µM BI处理的UOK276细胞中DQ-Red BSA的内吞摄取。误差线表示3个独立实验的平均值±SEM，每组至少评分1000个细胞。（F）在（E）中定量的相对内吞摄取的数据分布。（E）和（F）中的数据表示为相对值，因为对照组的平均值设置为100，以便于比较。通过单向ANOVA进行P值为* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001。
6. 全外显子组测序显示chRCC中TP53突变与PLCG2表达无关联
在所有chRCC病例中，约有30％的肿瘤抑制基因TP53具有体细胞突变的情况。据报道，突变型和野生型TP53蛋白均可调节内吞作用。我们怀疑TP53突变可能通过上调PLCG2表达来影响内吞作用的激活，为了验证这一假设，我们对所有chRCC肿瘤及其邻近的肾脏组织进行了全外显子测序（WES），以鉴定队列中chRCC的体细胞基因组突变，共鉴定出254个核非同义变异，其中147个为错义突变，13个无义突变，40个移码缺失，12个移码插入，20个框内缺失和2个框内插入。chRCC中每个肿瘤的肿瘤特异性核突变数范围为16至53（中位数24），与TCGA的chRCC队列相似。在所有已鉴定的突变中，TP53被发现是最频繁突变的基因，并且在9例chRCC病例中有4例发生了改变，其中2个肿瘤表现出无义突变，2个肿瘤表现出错义突变。而与先前的报道不同，我们在这次研究的队列中未发现PTEN突变。然后，我们比较了TP53突变体和WT肿瘤之间PLCG2蛋白的丰度，TP53 WT肿瘤的PLCG2蛋白水平高于突变体，但在统计学上无统计学意义（p = 0.056）（图6B）。TCGA的chRCC RNA-seq数据集，TP53突变体和WT肿瘤之间的PLCG2 RNA丰度也没有显著差异（图6C）。这些结果表明，TP53的突变状态不影响PLCG2的表达，因此chRCC中的内吞作用可以被激活，而与TP53中的遗传改变无关。
（A）通过chRCC的全外显子测序和匹配的肾脏组织鉴定出体细胞突变，每列代表一个样品。（B）在本研究中，TP53突变体和野生型样本中PLCG2的log2蛋白强度（n = 9）。（C）来自TCGA KICH研究（n ＝ 66）的TP53突变体和WT样品中PLCG2的log2 RNA RSEM。使用了两尾学生t检验；N.S.，表示无显著性差异。
这项研究采用并整合了蛋白质组学，转录组学（来自TCGA）和代谢组学方法以及WES，以深入了解chRCC中的代谢和遗传改变。chRCC的标志之一是对中央代谢途径的大量重新编程，糖酵解和糖异生共有它们的大部分酶，它们可以在两个方向上起作用，但是在chRCC中，糖异生特异酶的丰度只有显著降低（高达千倍）（图2）。肾脏是除肝脏之外唯一可以为生物体提供合成代谢葡萄糖的器官，但是净通量只能在一个方向上产生以避免无效循环，所有肾脏肿瘤似乎都放弃了这种消耗能量的途径，因为在肾小细胞瘤，chRCC和pRCC的蛋白质组水平以及在pRCC和ccRCC的转录水平上也报告了类似的结果，我们观察到的这些糖异生蛋白的丰度变化表明了癌症中常见的分化丧失。
与在chRCC中观察到的糖异生蛋白的丰度下降相反，糖异生基因和蛋白在其他类型的肿瘤中过表达。我们发现ALDOB表达增加有利于多种癌症的癌细胞增殖和转移，例如结肠癌，直肠癌和大肠腺癌，这也可能是chRCC患者转移潜力低和高生存率的原因之一。FBP1（糖异生的关键因素）的下调先前被报道与ccRCC的进展有关，并显示出抑制核HIF功能的作用。当FBP1在ccRCC中丢失时，会通过上调糖酵解靶基因进一步刺激代谢转换，同时我们也可以在蛋白质组数据中观测到chRCC中糖酵解酶的增加（图3）。但是，HIF不参与chRCC中葡萄糖代谢的调节，葡萄糖摄取对于维持肿瘤的生长非常重要，在chRCC中，葡萄糖的摄取明显低于ccRCC和pRCC，这可能是由于chRCC中的微血管密度低于ccRCC肿瘤的结果。因此，chRCC似乎缺乏经典营养供应链的支持。
除了参与糖异生的酶显著减少外，在chRCC中还观察到脂肪酸和氨基酸合成途径的蛋白质减少。氨基酸和代谢产物（如FAD，NADH，ADP，环状AMP和NAD +等）被视为必不可少的“能量载体”，其实际水平确实未发生变化，表明chRCC中有足够数量的构成要素和营养成分。chRCC中仅氨基酸中间体减少，反映出参与氨基酸代谢的途径活性较低。相反，在其他癌症类型中经常发现氨基酸代谢增加，从而促进增殖和转移，例如乳腺癌中的甘氨酸和丝氨酸代谢。
基于这些发现，我们假设chRCC以不同的方式优先获取营养，参与细胞回收机制的溶酶体和蛋白酶体通过内吞作用贡献并传递了新生物质，这些酶和蛋白酶体的含量大大增加。实际上，源自chRCC的细胞系UOK276在营养缺乏的条件下可以更好地利用大分子，并且补充BSA可以显著提高溶酶体的活性。与氨基酸代谢有关的途径减少与蛋白酶体、泛素介导的蛋白水解和溶酶体的增加同步，表明chRCC的主要适应性机制涉及生产，循环利用和能量代谢，例如促进维持蛋白质稳定或应对压力。
PLCG2是蛋白质组图谱鉴定最多的蛋白质之一，相对于健康人肾组织，chRCC中其相应的转录本也被高度上调。大胞饮体主要是从胞外液中吸收溶质，是由巨胞饮作用（称为胞吞作用）形成的，它由磷酸肌醇和几种Rab GTPases控制，调节膜运输的许多步骤，包括囊泡形成，囊泡运动和膜融合。而且，在chRCC标本中，大多数Rab GTPases也发现显著增加。在对PLCG2/IP3/Ca2+/ PKC途径进行药物抑制期间，我们在chRCC细胞中发现了大分子的胞吞过程显著减少。此外，据报道，内吞作用通过增加细胞体积和膜张力来抑制癌细胞的起泡和侵袭，从而降低了周围组织机械侵袭的可能性。
总之，chRCC的特征是大量代谢途径重新编程，糖异生减少，氨基酸代谢中断，证明了激活的内吞作用和随后增加的蛋白质降解对于chRCC从细胞外基质中获取营养以补偿并抵消葡萄糖摄取和氨基酸合成率的下降以及呼吸链活性的降低是必要的。此外，PLCG2 /IP3/Ca2+/PKC轴在内吞作用的激活中起着重要作用，并可能成为chRCC患者的治疗靶标。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33115803/
