综述 | Curr Dir Psychol Sci：利用细胞热位移测定法（CETSA）探究细胞过程中的综合蛋白组学
编译：苑志宇，编辑：Tracy、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
细胞热位移测定法（CETSA）是最近出现的一种有发展前景的技术，可以直接监测完整细胞和组织样品中蛋白互作状态及其功能调节。最近的数据表明，热位移质谱分析法（MS-CETSA）的使用发现了关于各种不同蛋白互作类别的准确信息，该方法非常适合用于研究细胞过程和药物作用过程中蛋白互作状态及调控作用。为更深了解CETSA的机理，并补充CETSA的实验结果，本文概述了MS-CETSA与其他蛋白质组学技术的全面和交互式使用如何为蛋白质组学提供新的分析平台。
论文ID
Current Directions in Psychological Science
内容
细胞是通过细胞分子之间许多特定的生化反应和相互作用来控制复杂而动态的内环境。蛋白质是大多数细胞过程中的关键角色，也是大多数治疗药物的靶标。我们对蛋白质的了解来自多种实验方法，一方面，对单个纯化的蛋白质或蛋白质复合物的研究可以提供对结构和机理的详细了解，而另一方面，基于质谱（MS）的蛋白质组学技术可以在单个实验中探究大部分蛋白质组的功能。
近几十年来，基于质谱的蛋白质组学发展迅速，改变了我们对细胞蛋白质组学各方面的理解。除了评估特定细胞和组织样品中的蛋白质水平外，不同的功能蛋白质组学技术现在还可以通过直接检测蛋白质与其他细胞分子（例如核酸，蛋白质）的相互作用来产生与蛋白质功能相关的综合信息，包括代谢物，或蛋白质翻译后修饰（PTMs），但是，大多数这些功能蛋白质组学技术依赖于工程细胞或化学探针，或需要在测量相互作用之前对细胞裂解液中平衡的样品进行分析，因此只能部分反映未受干扰的细胞中的情况；然而，对疾病和药物作用下的细胞过程中蛋白质的结论性理解，可能需要关于蛋白质组在其生理环境中的细胞功能调节互动的详细信息。
最近研究者引入了细胞热位移测定法（CETSA）作为研究在完整细胞中配体与蛋白质结合的第一种广泛适用的生物物理技术。该技术最初用于研究哺乳动物细胞中的药物结合，但现在已广泛用于验证和量化药物在不同物种的细胞和组织中的靶向作用。CETSA的观察结果是，加热步骤后，可以通过定量残留可溶性蛋白质的量来测量完整细胞中的蛋白质熔解曲线，当“蛋白质报告”需要反映细胞中蛋白质的状态时，科研者需要对许多蛋白质的CETSA测量非常严格，因为关键的测量步骤（即加热）是在细胞完整的情况下完成的。利用MS技术对溶解性进行定量时，MS-CETSA已用于鉴定各种药物（例如，罕见病用药，表型筛选命中，和易毒性药物）的未知靶标。然而，由于科研者引入了高分辨率MS-CETSA技术（2D-TPP，ITDR-CETSA和IMPRINTS-CETSA；图1a），他们可以很明显地看到生理配体对蛋白质的广泛调节，而这也反映出细胞中的其他过程，例如药物的下游效应或应激效应（图1b，c）。在细胞周期的研究中，探明MS-CETSA可以随细胞周期发生转变，有利于全面了解细胞生理过程中的相互作用。
我们引入了两个术语，PRINTS，即蛋白质相互作用状态来描述单个蛋白质的现有功能形式，以及水平细胞生物学（Horizontalcell biology）来描述有关细胞状态转换过程中此类相互作用调节的新观点，与许多研究仅针对蛋白质和其他细胞分子的“垂直”水平变化进行了对比。
尽管当物质结合或化学计量可能不足以诱导可测量的热位移时，并非细胞中所有相互作用的改变都会产生CETSA转变，但累积的研究（包括来自我们实验室的未发表数据）表明，人类蛋白质组中的数千种蛋白质可能会在MS-CETSA实验中显示不同反应，并可能显示PRINTS调节，反映了完整细胞中蛋白质的特定功能变化。因此，这些CETSA响应蛋白将使我们能够检测到细胞蛋白质组机器的哪些“齿轮”在特定的细胞过渡过程中移动，并且还可以在没有蛋白质水平变化的情况下捕获途径的功能变化，因此，MS-CETSA提供了一种新颖且更直接的手段来研究蛋白质组学水平的细胞过程中蛋白质的功能。但是，要全面探索该方法，还需要进一步的发展，例如，其中有一个挑战是，最初研究者通常不知道检测到的位移的具体结构起源，特别是当许多蛋白质具有多个相互作用点时；同样，还不知道特定的位移是激活还是失活，是否通过酶反映变量（通过调节底物或产物的水平），或者是否报告蛋白质在细胞中的重新定位。虽然只知道细胞蛋白质组机器中可通过CETSA访问的“齿轮”是否移动，但在特定的细胞反应过程中，其本身是非常有价值的，但将MS-CETSA数据与其他蛋白质组学数据集成在一起可能会产生更多的收益。 因此，这些CETSA反应蛋白将使我们能够检测出细胞蛋白质组机器的哪些“齿轮”在特定的细胞反应过程中移动，并且还可以在蛋白质水平不存在的情况下捕获反应进程中的功能变化。建立详细信息的细胞蛋白质组机械功能参考图，可在其中定义许多CETSA响应蛋白位移的生物物理起源（图1d），该图谱可能将适用于同一生物（例如人类蛋白质组）的多种细胞类型的研究，并在将来根据个体的特定结构及相互作用变化，作为直接解释复杂的CETSA数据库的参考。
图1 （a）CETSA的初始格式（即熔解曲线）已扩展为多种多维或高分辨率格式，例如2D-TPP，ITDR-CETSA和IMPRINTS-CETSA。（b）与测量生物分子水平的“垂直”细胞生物学相反，高分辨率CETSA格式的数据集可以捕获几种“水平细胞生物学相互作用”。这样的数据集可以捕获细胞蛋白质与其他生物分子（例如代谢产物，其他蛋白质和核酸）以及蛋白质修饰（例如PTM和氧化还原反应）的生理相互作用的全面情况。（c）将药物加入细胞后，用高分辨率MS-CETSA实验捕获的生理相互作用的简要信息。 虽然捕获了更常规的信息（例如直接药物结合剂和直接下游效应物），但也可以看到其他一些平行或非常规信息，例如药物代谢，排毒和药物诱导的应激反应。（d）将MS-CETSA数据与其他蛋白质组学数据（包括在裂解液中和工程细胞上进行的实验）整合，可以深入了解CETSA反应蛋白转变的生物物理起源，并有助于建立细胞的机械功能参考图。
1.蛋白质组学技术的互补性
最近有很多文章从不同方面对CETSA进行了深入的综述，在本文中，我们将介绍高分辨率MS-CETSA的实验现状和新兴观点，以及如何与其他蛋白组学技术协同使用的方法。在表1中，我们进行概述，指出不同蛋白质组学技术的适用性以及它们与CETSA的互补性。
多种蛋白质组学技术可以识别“主要相互作用”，回答以下问题：“哪个细胞分子已表达与之相互作用的蛋白质？”，即蛋白质组中每种蛋白质的可用PRINTS（表1）。 这类研究通常是在细胞裂解液中进行的，蛋白质在其生理环境中不再存在。许多非蛋白质组学方法也有助于绘制蛋白质组的主要相互作用，包括传统的重点研究以及蛋白质组范围内的双杂交相互作用。尽管研究者已经建立了一个非常有价值的初始路线图，用于理解蛋白质组学中潜在的相互作用，可以在两种细胞状态之间进行特定的转换，但是这些PRINTS的很大一部分可能不会出现在两种细胞状态中，或者可能无法在两种细胞状态中进行调节，再或没有两种细胞状态之间的过渡，因此没有产生CETSA移位。
为了更好地对蛋白质组学的功能方面进行了解，我们需要能够在细胞环境中捕获蛋白质的相互作用及功能调节。在许多情况下，科研者可以通过裂解过程中蛋白质的快速变性或酶的失活来稳定PTM的化学修饰，从而最大程度地减少扭曲作用。对于与蛋白质的非共价相互作用，即使在实验依赖于裂解物相平衡的情况下，也可以在许多蛋白质上检测到相关差异作为细胞变化的第一近似值。研究者已经尝试使用以下方法研究基于PRINTS的细胞差异：（1）有限的蛋白水解（LiP）和（2）氧化速率（SPROX）产生的蛋白质稳定性技术，其中他们已探测了潜在的功能/结构变化，随后通过检查蛋白质上特定位点可氧化或蛋白水解的可及性的变化来裂解细胞。在下一部分中，我们将讨论CETSA在完整细胞中捕获不同类型的生理相互作用的能力，并概述如何整合其他方法的信息以及CETSA裂解物实验，将来以更好地了解细胞生物学中特定细胞代谢水平。
表1 当前可用于解决不同问题的不同方法的对比
蛋白质与药物/小分子的相互作用，蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质复合物、蛋白质组以及蛋白范围内的蛋白质状态评估。
2.CETSA的蛋白质-代谢物相互作用和代谢组学
当代谢物经常与药物以较低的亲和力瞬时产生结合蛋白质时，起初科研者尚不清楚CETSA在细胞范围内可检测到代谢物结合的程度；然而，现在已经在许多细胞内通过CETSA实验中观察到由于代谢物结合引起的PRINTS的变化（图2a，b）。为了确定CETSA的严格性，我们研究了人类细胞裂解物中一组特征明确的核苷酸，这些核苷酸是可以捕获的，并具有最广为人知的相互作用，包括短时的底物和产物相互作用；然而，对于这些高度研究的核苷酸，科研者仅鉴定出少数新颖的相互作用。我们还发现，在暴露于外源胸腺嘧啶的完整细胞中，MS-CETSA可以监测到随着时间和浓度依赖性变化的代谢途径中代谢产物的积聚（图2c）。 ATP的裂解物研究产生了数百个结果，其中相当数量的结果与已知或注释的ATP结合蛋白相对应。两种不同药物对细胞中ATP产生的直接调节，鉴定出一小部分ATP结合蛋白，这些蛋白对生理浓度范围内ATP/ADP比值的畸变高度敏感。我们建议，该子集可以用作蛋白质集合，报告ATP/ADP比率的生理变化。同样，对CETSA响应的胸腺嘧啶核苷代谢酶也可以作为整体报告dTXP代谢产物的变化（图2c），并且在我们的实验室中，我们看到了针对其他类型代谢产物的高度敏感的蛋白质集合。对生理浓度范围内的特定代谢物水平敏感的蛋白质小团，可用作代谢物水平变化的细胞内探针，即CETSA的代谢组学（图2a）。
图2 （a）CETSA的代谢组学示意图。在生理浓度范围内，一小部分蛋白质对特定代谢物的敏感水平，可以通过使用蛋白质应答剂作为替代品，间接用于研究细胞内代谢物的水平。（b）在等温剂量反应（ITDR）实验中，代谢产物对一组反应的鉴定蛋白质的特异性和相对亲和力。颜色标明最小剂量阈值（MDT），黄色是最低的，蓝色是最高的MDT。相似的结构化代谢物往往具有相似的特征。（c）在细胞内实验中，将胸苷加入细胞培养物中并追踪蛋白反应30分钟，以检测胸苷的等温时间响应（ITTR）。（d）与G1 / S期相比，当细胞过渡到前中期时，核孔复合物（NUP）成员蛋白的IMPRINTS-CETSA图谱。次级复合体分配遵循Beck和Hurt总结的分配规则。从String数据库（http://string-db.org/）中检索到了经实验确认的由蛋白质节点之间的边缘指示的蛋白质相互作用。
3.蛋白质-蛋白质相互作用和复合物
二元蛋白相互作用的调节通常会产生热位移，例如在两个细胞周期研究中，有人提出了将PRINTS调节用于细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性激酶的结合。令人惊讶的是，CETSA可以捕获许多大蛋白复合物（包括核糖体和蛋白酶体）的结构变化，我们将这种现象的基础称为热邻近聚集（TPCA），其可能的生物物理基础是由于当最热敏感蛋白成分的展开时，驱动复合物一致沉淀，配合物在结构上同质性和计量行越大，TPCA可及的配合物的熔解曲线就越相似（相关）；因此，当蛋白质复合物在TPCA分析中显示出更高的相关性时，它们可能以更活化的形式存在，尽管特定的抑制剂复合物也可能变得更加同质。使用高分辨率MS-CETSA方法，我们还可以观察到许多蛋白质复合物的协同稳定或去稳定作用，这直接反映了配体与这些复合物结合的变化，例如，在细胞周期中监测参与染色质重塑，转录和翻译的复合物的PRINTS调节，也可能反映了与核酸相互作用的调节（图2d）。尽管TPCA分析为新型蛋白质复合物的预测增加了一些统计意义，但到目前为止，该分析依赖于使用经过充分验证的蛋白质复合物（即CORUM数据库）作为参考。
其他蛋白质组学方法已经从裂解液中与MS联用的各种形式中提取了关于裂解物中主要蛋白质复合物组成的综合信息。最近，诸如生化分级分离法之类的其他方法已被用于发现新型蛋白质复合物，这些裂解物实验构成了我们对现有蛋白质复合物库了解的核心，但是可以预料，这种方法不会捕获复合物的瞬时或不稳定成员。ATPCA分析表明，只有三分之二具有统计学意义的细胞复合物在裂解物中可见。
BioID和相关方法构成了新的方法，它们可以在完整细胞中鉴定新的、空间近端的或相互作用的伴侣蛋白。交联与质谱法（XL-MS）的结合已开始适用于复杂的生物系统，例如哺乳动物细胞，以探索构象动力学以及鉴定新型潜在的蛋白质相互作用。当BioID和XL-MS均适用于细胞研究，以评估蛋白质邻域或拓扑结构时，它们将提供可与CETSA数据协同作用的有价值的正交信息；同样，转录因子和染色质蛋白快速交联到特定DNA序列的信号可以直接反映细胞过程，并与此类蛋白的CETSA位移相关。最近，也已经有科研人员报道了用于在蛋白质组范围内研究RNA蛋白质相互作用的交联方法。
4.翻译后和氧化还原修饰
PTM在细胞信号传导（例如磷酸化，甲基化和乙酰化位点）中的化学稳定性各不相同，但是，在优化的实验中，通常可以获取有关特定PTM的细胞变化的相关信息，并且此类研究对于我们对基于PTM的信号传导的理解至关重要。当许多修饰（例如磷酸化位点）处于柔性环中时，它们可能不会直接影响蛋白质的稳定性，而其他修饰则处于结构性环境中。通常人们无法确定细胞蛋白的哪一部分被PTM修饰，如果只有一小部分蛋白质被修饰，则它们在标准MS-CETSA实验中通常不会产生变化。我们提供的证据表明，RBTS磷酸化可促进细胞周期中CETSA在RB1蛋白中的转移。最近的一项研究描述了基于CETSA的方法在全局检测响应于磷酸化的稳定性变化中的应用，许多其他PTM站点可能会产生CETSA位移，但是这些位移的程度尚待确定。
图3 （a）细胞中多部位定位蛋白的CETSA信号。哺乳动物细胞由许多高度组织化的区室组成，例如细胞核，各种细胞器（包括但不仅限于内质网，高尔基体，线粒体，内体，溶酶体和过氧化物酶体）和细胞质。蛋白质的翻译后移位决定了细胞进程，并可能使CETSA信号复杂化。在这种情况下，观察到的CETSA熔解曲线是在不同亚细胞位置上所有不同亚群（即不同PRINTS）的加权平均值。（b）从IMPRINTS-CETSA细胞生物学研究中了解命中类别的决策树方案。我们引入了一个简单的两字母编码系统，以引用在IMPRINTS-CETSA数据集中观察到的蛋白质的不同反应组，其中第一个字母（C或N）指示CETSA蛋白质水平是否发生变化，而第二个字母表示CETSA稳定性是否发生变化。在此决策树中，我们指出，在复杂的细胞生物学系统中，CETSA从业人员应始终考虑蛋白质的不同反应，例如周转率（合成和降解）、重新定位、上下文相关的提取和热稳定性。（c）来自假设的高分辨率CETSA数据集的STRING图，显示了不同蛋白质在细胞的IMPRINTS实验中的活动。尽管具有CETSA响应（白色节点），但蛋白质仍不会移动（保持不受影响），或者显示孤立的PRINTS调节作用（绿色节点）。此外，移动中的蛋白质复合物（橙色节点）中的蛋白质倾向于一起移动。此外，还显示了一些细胞通路（粉红色节点）和对代谢物敏感的集合（蓝色节点）。
5.蛋白质水平变化与细胞定位
在真核细胞中，区室化是调节细胞过程的重要层，其中适当的空间分隔允许在正确的位置控制蛋白质功能。蛋白质定位的全面亚细胞定位已使细胞器组成和动力学的研究成为可能，特别是通过将基于梯度离心或差异离心的细胞分级分离与定量蛋白质组学结合在一起。区室化通常与蛋白质相互作用和激活状态的修饰耦合，这可以反映在变化中的稳定性（图3a）。尽管第一个蛋白质组CETSA的研究表明，生理环境对蛋白质的解链特性有影响，但尚未存在有关不同位置之间蛋白质稳定性变化系统分析的报道。在获得蛋白质水平和蛋白质稳定性信息的IMPRINTS-CETSA和2D-TPP格式中，应注意的是，对于某些蛋白质和蛋白质复合物的经典蛋白质组学实验，CETSA实验中测得的水平变化与从中获得的水平变化非常不同（图3b），这表明在CETSA实验中，蛋白质改变了其相互作用或定位，影响了其保留在可溶性级分中的倾向，这可能反映了细胞膜或细胞器的重新定位，后者在CETSA实验中通常无法完全溶解。在两项哺乳动物细胞周期CETSA研究中进行的蛋白质溶解度转变分析表明，科研者可以提取有关特定蛋白质的额外信息，例如在有丝分裂过程中的核膜层板和核孔复合蛋白的显着作用。MS-CETSA实验与亚细胞分级分离或BioID类型邻近实验的结合现在可能能够更详细地解析水平或稳定性受到调节的CETSA响应蛋白某些子集的物理基础。
6.总结
如前所述，MS-CETSA现在提供了一种独特的方法来研究完整细胞中的蛋白质功能，每种哺乳动物细胞类型中的数千种蛋白质很可能具有CETSA响应性，即报告了一种或多种相互作用的调节，涉及生理配体，例如代谢产物，其他蛋白质，金属和核酸。在系统生物学水平上，MS-CETSA将报告哪些蛋白在细胞状态转变（包括药物治疗）过程中具有调节的相互作用，即蛋白质组机器中的哪些齿轮正在转动（图3c）；同样，在已知的CETSA反应蛋白中，它还将指示哪些齿轮没有移动。未来的挑战将是如何将CETSA反应蛋白与相互作用的配体和稳定性变化的结构机制相关联，从而可以确定信号反映的是激活或失活，代谢通量或亚细胞再定位，MS-CETSA实验、其他蛋白质组学技术以及代谢组学和现有的生物信息学资源将是推导这种关系的关键。与其他蛋白质组学技术的整合还将提供CETSA无法直接访问的有效信息，例如PTM位点的许多调节方式和DNA/RNA结合。随着对CETSA反应的人类蛋白质组的力学模型的出现，我们预测基于CETSA的细胞状态转换研究将获得详细、全面和高度相关的信息，以更好地理解完整细胞和组织样本中蛋白质组的功能调节。