科研 | 中国农业科学院：使用iTRAQ技术对悬铃叶苎麻减数分裂相关蛋白进行差异蛋白质组学分析（国人佳作）
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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转录组学已经鉴定出许多与无融合生殖相关的候选基因;然而，无融合生殖的分子机制尚不清楚，阐明其机理对扩大其在作物育种中的应用具有重要意义。因此，我们采用等压标记技术，对悬铃叶苎麻通过不同繁殖方式产生的蛋白在功能性大孢子阶段的表达进行了相对和绝对定量标记技术的研究。我们鉴定了40个差异丰度蛋白与减数分裂相关，其中大多数参与“应激反应”。功能分析表明，较低水平的活性氧(ROS)在诱导减数分裂发育中起重要作用，而与ROS调控、细胞壁修饰和热胁迫下稳定性相关的蛋白在双孢子无性系的发育过程中起着至关重要的作用。我们的研究结果证明，压力可以通过ROS含量诱导无融合生殖向性生殖的转变，而增加的压力耐受性和次级代谢物成分可以缓冲ROS的作用。这些蛋白的精确协调参与了相互关联的调控机制，可能共同作用于从有性发育到无融合生殖发育的过渡。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 蛋白质鉴定和定量
我们采用iTRAQ shotgun定量方法比较JG2组与JG1组、ZJJ组与JG1组、HD组与JG1组的蛋白丰度，所有质谱原始数据均保存在iProX(登录号：IPX0002303000 / PXD020132)，肽匹配的细节见表S1。我们共鉴定出3011个、3036个和2900个独特肽≥1的蛋白（其评分为HT>0(表S2)），并针对其中2134个蛋白进行评价。基于单个复制的表达数据，我们进行了主成分分析(PCA)，定量可视化不同细胞类型之间的关系(图1)。虽然只有46.7%的总变异能被前2个主成分解释，但12个数据点被清晰地划分为4个离散组，每个细胞类型的个体复制正确地形成一个紧密的集群，表明数据是可靠的。
图1 iTRAQ数据的PCA图根据蛋白质表达水平显示样本的特征
2. DAPs在减数分裂中的功能注释
根据严格的截止阈值-1.5和1.5的表达水平变化筛选DAPs，我们发现，JG2与JG1相比、ZJJ与JG1相比、HD与JG1相比，分别有109、68和148个蛋白表达上调，而分别有127、119和255个蛋白表达下调(图2)。
我们创建了维恩图探讨重叠在三组之间的DAPs和确定10 DAPs的调节,而30 DAPs的在所有组表达下调(图3)，而40 DAPs被确定为与减数分裂相关的蛋白质，是独立的倍性水平(表S3)。
为了进一步阐明功能分布，我们根据GO功能对40个与减数分裂相关的DAPs进行了表征(图4a)。结果表明，35、39和36个DAPs分别被划分为生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)。BP分类注释了749个术语，显著丰富了231个术语；在CC分类中，106个术语被注释，36个术语被显著丰富；在MF分类的150个注释术语中，有48个显著丰富的术语。为了演示注释的细节，我们进行了GO层次结构，其中包含10个显著增强的术语(图4b)，BP分类在“应激反应”(52.5%)、“对非生物刺激的反应”(32.5%)和“对外部刺激的反应”(27.5%)中被发现最为丰富。CC分析显示，“细胞外围”(42.5%)、“细胞外区域”(35%)和“外包覆结构”(27.5%)是最丰富的词汇。MF类下，“氧化还原酶活性”(27.5%)、“氧化还原酶活性，作用于过氧化物作为受体”(10%)和“过氧化物酶活性”(10%)显著表达。
然后我们对DAPs进行KEGG分析，并对无染色体分裂的表达进行鉴定。三种途径，包括“生物合成次级代谢产物”(27.5%)，“苯丙素生物合成”(7.5%)和“氰基氨基酸代谢”(5%)被鉴定为最富集的途径(图4c)。根据排名前十的KEGG通路，PPI分析进一步阐明了与无性系减数分裂相关的DAPs相互关系和表达模式(图5)。通过可视化的相互作用网络，我们发现CAT2、Hsp90-1、SOBIR1相互作用的蛋白超过两个，其中“次生代谢产物的生物合成”连接的蛋白最多。
图2 在三种繁殖方式的两两比较中，上调和下调蛋白质的定量。
图3 维恩图显示了三对生殖模式比较中DAP的重叠
（a）上调和（b）下调的差异表达基因显示。
图4 40个与减数分裂相关的DAPs的功能注释
（a）每个类别中的术语数量；（b）前10个显著丰富术语的GO层次结构；（c）KEGG路径丰富分析的气泡图。
图5 利用拟南芥植物互作数据库对与减数分裂相关的DAPs进行PPI分析。
3. 通过PRM分析验证DAPs
在PRM分析中，我们选择了7个与减数分裂相关的DAPs对蛋白质丰度进行定量验证（表S4）。尽管PRM在JG1和JG2及HD中我们均未检测到Unigene030163_01.p1和Unigene005889_01.p1，但在四种细胞类型中，PRM和iTRAQ之间的表达水平变化相似。其他5种蛋白的表达水平（Unigene016443_02.p1、Unigene018419_01.p1、Unigene041914）_01.p1、Unigene034539_01.p1和Unigene022493_01.p1）在PRM和iTRAQ分析之间是一致的，因此，PRM验证证明了iTRAQ数据的高可靠性和可信性。
讨论
1. 降低活性氧水平可诱导减数分裂的发生
在自然无融合生殖中，专性发育的启动受到无融合生殖通路的平行抑制，无融合生殖通路在无孢子期甚至随后在双孢子期同步进行器官。最近有观点和见解认为，压力可以通过活性氧含量诱导无融合生殖向性转变，在毛茛属、毛茛属、雀稗属和毛茛属的无融合生殖系统中有研究者发现了这种潜力的证据。
这一观点表明，性途径是ROS诱导的DNA损伤清除有害突变的必然结果。还假设氧化DNA损伤和基因SPO11相互作用使双链断裂和减数分裂重组得以进化，而奇怪的是，低水平的ROS在玉米花药中仍然促进减数分裂的发生。一种可能的解释是，大多数无融合生殖系谱系都是多倍体，其耐逆性和次级代谢产物的数量和组成都有所增加，可以通过更多染色体组缓冲活性氧效应。而一个有效的抗氧化系统包括抗氧化剂和自由基清除酶，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶等，可以清除和调节ROS的稳态。
根据三尖双歧杆菌细胞型组DAPs的Venn图分析，有21个DAPs（占DAPs总数的52.5%）参与了“应激反应”，这与功能性大孢子形成期有性胚珠和无融合生殖胚珠的大孢子应激反应存在显著差异的假说相一致。在这些DAPs中，我们鉴定了四种与ROS调节显著相关的蛋白质，包括Unigene005889_01.p1、Unigene030163_01.p1、Unigend025958_01.p1和Unigene030932_01.p1。
蛋白质Unigene005889_01.p1与AtBGLU17同源，AtBGLU17是一种β-糖苷酶，属于糖苷水解酶家族1，在发育过程和应激反应中起着重要作用。已知包含AtBGLU17的亚家族可水解一些异黄酮和异黄酮，可以作为抗氧化剂具有生物活性。无融合生殖花中的BGLU17会影响黄酮类化合物的可用性，黄酮类化合物可能可以作为抗氧化剂最小化雌性大孢子细胞中的ROS（如H2O2），并触发从有性生殖到无融合生殖的转变。
值得注意的是，蛋白质Unigene030163_01.p1与拟南芥CAT2同源，在功能性大孢子形成阶段，在无融合生殖花中上调。过氧化氢酶主要催化歧化反应和分解过氧化氢，可防止氧化损伤。在被子植物中，过氧化氢酶仅由三个基因编码，它们具有高度的序列相似性，并且主要定位于过氧化物酶体中，而在拟南芥中，过氧化氢酶的活性降低到80%。
Unigendne025958_01.p1和Unigene030932_01.p1分别与拟南芥PER5和PER3同源，与有性花相比在无融合生殖花中表达下调。PER5和PER3属于典型分泌型（Ⅲ类）植物过氧化物酶家族。过氧化物酶可以利用酚类化合物作为辅助因子催化H2O2生成酚类自由基化合物，过氧化物酶也可以作为消耗H2O2和产生ROS的催化酶，它具有不同的功能，参与木质化、细胞伸长和抗逆性等过程。
因此，上述四种蛋白质将减少活性氧和酚自由基化合物。无融合生殖花中存在低水平的ROS，可能促进无融合生殖的发育。值得注意的是，降低H2O2水平可导致玉米花药中孢原细胞的形成并增加减数分裂命运的获得。此外，一些研究结果表明，在适当范围内降低ROS水平可导致细胞增殖受到抑制和分化减少。我们推测胚珠中ROS含量降低到一定阈值以下可能是减数分裂发生的必要条件。
2. HSP90和HSP70及其相互作用蛋白可能参与了减数分裂的调控
我们发现，与拟南芥AtHsp70-4、AtHsp90-1、At5g28840和FKBP62同源的Unigene016443_02.p1、Unigene041914_01.p1、Unigene018419_01.p1和Unigene034539_01.p1在无融合生殖花中的表达水平高于有性生殖花。
Hsp70-4和Hsp90-1属于热休克蛋白（HSPs），是一组独特的高度保守的分子伴侣，是细胞在应激条件下生存所必需的。热休克蛋白作为分子伴侣稳定蛋白质，需要被确保其正确的组装和折叠。热休克蛋白普遍存在，在信号转导、蛋白质靶向和降解中起着关键作用，并与参与各种发育调控过程的热休克因子（HSF）相互作用。在我们的研究中，Hsp90-1和Hsp70-4在无融合生殖花中的上调表明它们在无融合生殖发育中可能具有特异的重要作用。
AtHsp70-4是拟南芥胞质/核Hsp70亚类的成员，参与拟南芥对非生物胁迫的耐受和发育调控。值得注意的是，AtHsp70-4通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）与Hsc-70相互作用蛋白的E3连接酶羧基末端在胚胎发生中发挥重要作用，被认为是生殖命运决定和无融合生殖系规范的重要调节因子。
在大肠杆菌和拟南芥中我们发现了Hsp70与gd-D-甘露糖差向异构酶（GME）的共纯化，暗示Hsp70可能是GME的分子伴侣，而与拟南芥中的At5g28840（GME等位基因）同源的Unigene041914_01.p1在三尖杉无融合生殖花中的表达增强，这可能表明它们在无融合生殖过程中与环境因素相关的生殖发育调控中起作用。此外，GME还调控着Lascorbate生物合成的酶活性，Lascorbate是一种重要的水溶性抗氧化剂和参与抗逆的酶辅因子，通过促进细胞G1-S期的进程来调节细胞分裂，而将其直接注入卵巢，可通过改变胞质分裂平面诱导单卵双生和多胚轴。据报道，GME影响果胶-鼠李糖乳糖醛酸II（RG-II）的合成，在花粉发育和胚胎发生过程中，在较高水平的分化细胞中可检测到。
AtHsp90-1属于细胞质亚科Hsp90，包含高度保守的C末端MEEVD序列。应力诱导型AtHsp90-1呈现几种寡聚形式，并且在高寡聚状态下观察到比单体或二聚体形式更高的保持酶伴侣活性。因此，Hsp90-1的上调可提高寡聚态比率，增强保持酶伴侣活性，从而有助于稳定靶蛋白，保证其正常功能。
最近的证据表明，AtHsp90-1和AtROF1（FKBP62）的积累在热应激反应中起着核心作用，其通过延长蛋白质耐热性和维持在高温环境中生存所必需的小HSP。AtROF1与AtHsp90-1相互作用，它们向细胞核的移位是由热应激诱导的，也依赖于AtHsfA2的存在。有一种可能性是AtHsp90-1与AtROF1结合，形成一个与AtHsfA2相互作用的复合物，以识别其他候选核蛋白，如组蛋白。它们的作用是通过DNA甲基化控制基因表达，抑制或激活其他组蛋白修饰，甚至调节整个染色体结构表观遗传学，这可能是调控无融合生殖的主要驱动力之一，而以往的研究结果也与这一假设相符。正常情况下，AtROF1与细胞质中的AtHsp90-1相互作用。热应激可刺激AtHsfA2与AtHsp90-1和AtROF1相互作用，负责其复合体向细胞核的移位，这种相互作用稳定了AtHsfA2并维持了AtHsp90-1合成在应激恢复期的连续性，从而使细胞在热应激下能够正常伸长、分裂和分化。
在我们的研究中，我们鉴定了Hsp70和Hsp90及其相互作用蛋白的表达增强水平。如上所述，它们中的任何一个都可以调节细胞分裂和/或生长，但它们的协同作用对于无融合生殖花中的大孢子母细胞避免减数分裂可能更为重要。它们防止氧化或热应激引起的有害突变的功能似乎与无融合生殖系谱系有关，而未来的分子研究应该有必要阐明它们之间的相互作用，然而，Hsp70和Hsp90的连接以及它们相互作用的蛋白At5g28840和FKBP62进一步支持了氧化还原状态对无性繁殖的重要性。
3. 还鉴定了其他参与细胞壁修饰的蛋白质
在无融合生殖细胞的发育过程中，细胞壁的动态变化和无融合生殖细胞的发育过程中都被观察到。在三尖双歧杆菌中，我们在减数分裂阶段鉴定出一组参与细胞壁修饰的蛋白质，包括上文概述的At5g28840、MEE23、FLA12和XTH2（表S3）。MEE23，也被称为小檗碱桥酶样酶15，氧化单信号醇进行聚合，从而参与细胞壁的形成，MEE23在拟南芥胚乳发育和极核融合中也是必需的。FLA12属于一个类似fasciclin的拟南芥半乳糖蛋白（FLAs）大家族，通过参与拟南芥中的纤维素沉积来影响细胞壁的结构和组成。XTH2是木聚糖内转葡萄糖基酶/水解酶（XTH）家族的成员，因此，有必要对这些蛋白质的积累进行进一步的研究，特别是不同植物的沉积模式以及相关的胚胎形成模式有所不同，这可能解释了JG2、ZJJ、JG和JG基因表达上调的原因，和HD细胞类型。
我们还鉴定了一些拟南芥同源物在减数分裂中的潜在作用。Unigene008135_01.p1与拟南芥富含甘氨酸RNA结合蛋白7（RBG7）同源，在无融合生殖花中表达上调。AtRBG7调控多种靶点的前RNA选择性剪接，影响赤霉素的生物合成和脱落酸的调节。在这些上调的蛋白中，我们发现了两个与拟南芥组蛋白同源的蛋白：H2B.8和H2B.11。在拟南芥中，已有11种组蛋白H2B被鉴定出来，其中10种（包括H2B.11）的氨基酸序列相似性超过80%，而H2B.8的氨基酸序列相似性仅为44%，H2B.11作为典型的H2B蛋白特异性存在于细胞周期的S期。然而，我们已经发现拟南芥H2B.8在花粉粒中作为雄性配子特异性H2B变体特异性表达，用于染色质重塑。RNA沉默和组蛋白修饰可以通过调节DNA甲基化来调节基因活性，但在无性发育过程中它们的特殊重要性还有待于进一步的研究。
结论
由于无融合生殖研究中的难题尚未解决，即基因调控和分子机制尚不完全清楚。我们对有性生殖和无融合生殖的三尖双歧杆菌和Boechera进行了比较转录组分析，结果表明，在大孢子发生过程中，参与信号转导、细胞周期调控和蛋白质降解的基因活性不同。为了缩小候选基因的范围，区分倍性和种间的影响，后续应采用差异表达分析法分析珠心组织有性和无融合生殖材料的基因表达，特别是与细胞发育、蛋白质降解和激素途径有关的基因。
我们进行了一项基于iTRAQ标记技术的定量蛋白质组学研究，以区分三尖双歧杆菌在减数分裂阶段的无融合生殖形式和有性形式,这是首次对无融合生殖发育进行蛋白质组学分析。我们共鉴定出40个DAPs与减数分裂相关，且与倍性水平无关。生物信息学分析表明，这些蛋白主要参与应激反应，特别是与ROS调控、细胞壁修饰和热胁迫下稳定性相关的蛋白质在二孢子减数分裂的发育中起着关键作用。我们的研究结果证明了应激可以通过ROS含量诱导无融合生殖向性行为的转变，并且应激耐受性成分的增加以及次生代谢产物可以缓冲ROS效应。在无融合生殖三尖双歧杆菌的高效抗氧化系统中，参与相关调控机制的蛋白质可以系统地调节ROS的稳态，这些蛋白质在抑制和激活途径中的精确协调可能在有性生殖向无融合生殖发育的转变中共同作用。我们的发现为进一步从蛋白质水平研究无融合生殖的分子机制提供了基础。