编译：大师球，编辑：十九、江舜尧。
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导读
心脏病是全球范围内引起人类死亡的主要疾病之一。发生心脏梗死（MI）时会有数十亿多心脏细胞（CMs）死亡。成年哺乳动物心脏损伤后再生能力有限，而新生儿心脏在出生后短时间内很容易再生。为了揭示新生儿心脏再生背后的分子机制，本文对MI后7天再生和非再生小鼠心脏转录和表观基因组进行了对比分析。通过基因表达特征与染色质活性或抑制相关的组蛋白标记进行分析，确定了新生儿心脏再生及再生的抑制的转录特征。该研究结果显示再生心脏具有独特的免疫应答，且在再生过程中活跃保留了胚胎心源基因程序。确定了编码细胞因子的CCl24和mRNA结合蛋白Igf2bp3，可以作为以前未识别的心脏细胞增殖调节因子。该研究为新生儿心脏再生的分子基础提供了新的观点，并确定了新的促进心脏再生的基因。
原名：Mechanistic basis of neonatal heart regeneration revealed by transcriptome and histone modification profiling
译名：转录组和组蛋白修饰揭示新生儿心脏再生能力的基础
期刊：PNAS
IF：9.58
发表时间：2019. 7. 23
通讯作者：Eric N. Olson
通讯作者单位：德克萨斯大学西南医学中心哈蒙再生科学与医学中心
DOI号：10.1073/pnas.1905824116
试验分别选取出生1日龄（P1，有再生能力）和8日龄（P8, 无再生能力）的小鼠心脏（如图1A），并结扎冠状动脉前降肢或进行假手术。然后在术后/或假手术后1.5 d , 3 d和7d 分别收集梗死心室，进行测序分析。
1 心脏再生过程中转录组发生了变化
三铬染色显示手术后1.5 d两组心脏均出现大面积梗死，但P1组心脏在术后7 d（P1+7 dpi）梗死大部分恢复，仅有少量梗死发生。而P8组心脏在术后3（P8+3 dpi）和7 d（P8+7 dpi）表现出广泛的纤维化、壁变薄和心室扩张。分析发现，根据所有转录组测序（RNA-seq）的相似性，将样本聚类为4个类群（图1B）。其中P1+1.5 dpi样本独自形成了一个类群（类群3），反映了P1心脏对MI的特殊应答。P1 + 3 dpi、P1 + 1.5 dps和P1 + 3 dps样本组成了第4类群，而P1 + 7 dpi组与其它的假手术组以及P8的假手术组的样本组成了类群1。表明MI发生3和7 d后，再生心脏已经拥有类似于同年龄未受伤的心脏的基因谱。P8组心脏MI后形成了一个独特的类群2。未受伤的P1和P8心脏分别聚类到了类群4和类群1，表明心脏发育过程中转录的改变（图 1B）。总体实验数据表明，再生的关键转录调节发生在心脏损伤后的初始反应阶段，使得P1再生心脏基因表达迅速恢复到与未受伤小鼠心脏基因表达一致。
2 幼龄心脏再生与损伤有着截然不同的信号通路
为了探究P1心脏特有的损伤应答基因，本研究又将显著上调表达的差异基因进行富集。对富集的差异基因聚类分析确定了6个基因模块，这些模块在P1和P8心脏受伤后优先上调表达（图1C）。在P1时间点，GO聚类分析主要涉及免疫过程（如炎症反应和白细胞活化）。P8+1.5 dpi时间点富集最多的GO条目是细胞周期、P8 +3 dpi主要富集的条目是细胞迁移和附着力，P8 + 7 dpi则是细胞外基质组建。反映了P8心脏受损后心脏激活纤维化重塑（图1C）。进一步的基因富集分析（GSEA）鉴别了P1和P8心脏损伤后的动态调节生物过程（图1D）。P1和P8时间点免疫反应通路被高度富集，并在P1 + 1.5 dpi达到峰值，而P8心脏在P8 + 3 dpi达到峰值。此外，P8 + 3和P8 + 7 dpi表现出最强的纤维化重塑过程。奇怪的是在P8 + 1.5 dpi心脏中观察到MI诱导细胞周期基因发生显著变化，而在P1心脏中并未改变，可能因为P1小鼠的心脏细胞一直处于高表达水平的细胞周期中。RNA-Seq的结果也表明细胞周期相关基因无论在MI或假手术组，其P1 + 1.5和P1 + 3中均高度表达，而从P8（P1+7 dps）开始细胞周期相关基因降低表达。此外，MI后P1+1.5 dpi和P8心脏的免疫组织化学显示P8心脏成纤维细胞的细胞周期激活较多，而细胞周期激活主要在P1的CM细胞中（图1E）。这说明，P1 CM中内源性细胞周期基因编程在心脏再生期间被激活。而P8 + 1.5 dpi心脏则出现心脏纤维细胞周期基因的活化，进而导致心肌纤维化。这些发现共同揭示了心脏再生中独特的损伤应答和转录动态调节。
图1 转录组学揭示再生和非再生小鼠心脏中的特征性应答。（B）RNA-Seq中各转录样本间的斯皮尔曼相关性。筛选出了四个不同的基因类群。（C，左侧）MI诱导的基因变化倍数值（Log 10 |FC|）。通过比较各组转录本与相应组假手术组的变化倍数。根据不同时间变化最大的基因聚类条目被分为聚类为6个亚群。（C，右侧）显示6个聚类中上调表达基因中变化最大的GO富集条目。（E）P1 + 1.5 dpi、P1 + 1.5 dps、P8 + 1.5 dpi和P8 + 1.5 dps心脏横切面cTnT紫色vimentin（红色）和Ki67（绿色）蛋白的免疫荧光染色。细胞核用Hoechst（蓝色）复染。
3 与新生儿心脏再生相关的染色质活性区域
为了解小鼠心脏对损伤转录组应答的机制，作者又选取P1和P8心脏用H3K27ac组蛋白修饰的表观遗传方法进行了进一步分析（图1A）。结果显示基因组中有13，447个峰在MI组上调，其中大多数是内含子（48%）或基因间区段（35%），只有8%被映射到启动子（图2A）。这些结果与DEG观察到的趋势相似。为了鉴别再生心脏梗死后特有的H3K27ac峰，作者又根据不同时间点峰值进行聚分析,确定了MI后上调H3K27ac峰值的6个模块，这些模块特定于P1和P8心脏损伤后的每个时间点（图 2B）。用注释工具进行分析发现，一般免疫反应包括炎症和白细胞活化在P1+1.5 dpi（模块1）、P8+3 dpi（模块5）和P8+7 dpi（模块6）中高表达。这与GSEA（图1D）中观察到的免疫反应动力学一致。此外，P8+7 dpi（模块6）中的峰值与纤维化重塑过程相关，表明最明显的损伤反应（图2B）。值得注意的是血管发育过程在P1+3 dpi（模块2）中优先得到富集，突出了新生心脏对损伤应答的独特染色质区域（图2B）。总之，这些发现表明，表观基因组H3K27ac染色质表观对再生和非再生心脏损伤有着不同的应答，并突出了再生心脏中染色质表观活性的独特动态。为了确定基因表达的变化是否归因于染色质活性的变化，作者又检测了MI后上调H3K27ac基因峰与其最近基因的表达之间的相关性，总体结果显示表观基因组与转录调节存在正相关。数据表明MI后GO上调模块（图1C）和H3K27ac峰值模块（图2B）基本一致。为了验证MI上调染色质活性区域与损伤后的MI上调基因的关系，作者选择了2个MI上调H3K27ac峰，并用原位杂交对其附近基因进行检测。结果显示第一峰位于Fhl1基因的内含子区域。在MI后的P1和P8心脏中，这个区域在多个时间点被激活并在P8+3 dpi（图2C）出现峰值。同时RNA-seq也显示Fhl1是一个MI上调基因。与假对照相比，小鼠心脏部分的原位杂交显示，在梗塞周围区域有大量的Fhl1上升调节（图2C）。第二个候选区域位于Tgm2基因上游约20 kb。与P8+3 dps相比，P8+3 dpi组H3K27ac在此区域的沉积和Tgm2基因表达均显著上调。P8+3 dps原位杂交显示梗死边缘区和右心室壁上表现出强烈的Tgm2表达（图2D）。转录组和染色质活性曲线共同揭示了受伤后心脏再生和重塑过程中暂时激活的各种生物过程。作者又用motif分析识别心脏再生期间控制基因表达增强相关转录因子（TFs）。发现MI上调基序在1个或更多时间点被富集，这是再生P1心脏比P8非再生心脏（图2E）独有的基序。P1+1.5 dpi组优先富集了NF-κB、Foxh1和Stat5等转录因子，这些因子在新生儿心脏再生中可能起重要作用。
图2 H3K27ac组蛋白修饰ChIP-Seq揭示损伤诱导的染色质激活区域。（A）饼图显示MI后富集的H3K27ac基因组峰值分布。（B，左）与假手术组相比，所有MI激活的H3K27ac峰的分组和最大变化值按时间重排的热图。（B，右）-log10 P值表示每组峰值变化最大时GO聚类条目。（C上）H3K27ac ChIP-Seq显示Fhl1内含子基因在P8 + 3 dpi和P8 + 3 dps时的峰值活性。（C，下部）原位杂交在缝合水平上显示P8 + 3 dpi和P8 + 3 dps时心脏横截面中Fhl1 mRNA的表达（比例尺，500μm）。（D，上）H3K27ac ChIP-Seq显示Tgm2增强子在P8 + 3 dpi和P8 + 3 dps时的峰活性。（D，下）原位杂交显示P8 + 3 dpi横切面中Tgm2 mRNA的表达（比例尺，500μm）。（E）热图显示在不同时间点TF结合基序优先富含MI上调增强子。只显示了P8 + 3 dpi和P8 + 7 dpi的前10个富集的TF结合基序。
4 再生和非再生心脏的不同免疫反应
H3K27ac ChIPSeq峰簇在P1 +1.5 dpi和P8+1.5, 3和7 dpi时，出现聚类最多的GO条目是免疫系统过程、炎症反应和白细胞激活。此外，他们就近的基因表达与H3K27ac峰值强度也呈正相关（图3B）。因此，ChIPSeq和RNA-Seq在P1心脏中都显示出急性和暂时性免疫反应，而P8心脏出现较慢但持续性的免疫反应（图3A和B）。同时作者也观察到在P1+3和+ 7 dpi（图3A）免疫相关H3K27ac峰的强烈失活，猜测是否存在cis调控元件抑制了峰值，进而保护心脏免受免疫损害。因此作者又分析了抑制性组蛋白标记 H3K27me3（图 1A）的基因组区域，并在已识别的免疫调节区域（图 3C）上绘制了H3K27me3 信号。结果在MI后P1不同时间点观察到平均 H3K27me3信号从P1+1.5 dpi逐渐增加，同时平均H3K27ac信号减少。相反这一趋势在P8心脏中出现反转，其中H3K27me3信号在P8 + 3 dpi和+ 7 dpi时随着H3K27ac信号的增加而降低（图3C）。有趣的是，在P1 + 7 dpi心脏中这些免疫应答区域的平均H3K27me3信号在MI之后高于假手术组，与这些免疫应答区域H3K27ac信号的失活相吻合。作者还发现了一组在P1和假手术组中均上调的H3K27me3峰值信号（图 3D）。表明P1心脏损伤后H3K27me3抑制性标记的增加会削弱新生儿心脏再生期间的免疫反应。
为了进一步描述P1和P8心脏MI后不同时间点的免疫反应差异，作者确定了512个免疫系统相关基因（GO：0009987）。表明某些免疫反应途径在P1或P8心脏中得到优先富集（图3E），如对病毒的反应、T细胞活化、NOD样受体信号转导以及体液免疫反应通路的上调仅出现在P1心脏中，而细胞外溢、血管发育、内分泌和组织重塑通路只在P8上调免疫基因中表达。免疫细胞通过旁分泌调节伤口愈合和组织再生。因此作者又通过CM增殖来识别可能促进新生儿心脏再生的分泌免疫因子。在MI后在P1心脏中优先诱导的1163个基因（图1C中的模块1至3）中发现47个免疫相关基因注释到GO分泌条目。在这些基因中，Osm、Csf1 和Enpp2是以前曾被证明能促进CM去分化和/或受伤后生存的基因。接下来，作者从中选取了6个以前在心脏再生期间没有报导的基因，测试它们促进新生儿大鼠心室心脏细胞（NRVM）体外增殖的能力（图3F）。对NRVM中这些基因或重组蛋白进行过表达，然后用EdU染色发现重组CCL24呈剂量依赖性增加细胞增殖（图3G），免疫染色也显示加入重组CCL24后NRVM增殖能力较强（图3H）。这些数据表明P1心脏巨噬细胞分泌的损伤诱导因子CCL24可以作为促细胞分裂剂在新生儿心脏中促进CM增殖。
（A）所有样品与免疫反应相关的GO条目H3K27ac峰值评分。（C）MI后每个时间点在P1和P8心脏中A标识的免疫相关峰的H3K27ac（左）和H3K27me3（右）的标准化平均信号（y轴）。（D）MI后上调H3K27me3峰簇处的H3K27me3信号富集的与免疫反应相关的GO条目。（E，左）显示与免疫相关的MI-up基因的log2倍数变化|FC|，这些基因进一步聚类为富含P1的基因（橙色条，156个基因），常见（绿色条，221个基因），和富含P8（蓝色条带，135个基因）的簇。（E，右）P1和/或P8富集的免疫相关基因簇的最富集的GO条目。（F）显示MI后不同时间点所选免疫相关分泌因子的z-score倍数变化。（G）CCL24重组蛋白促进CM增殖。BSA阴性对照，CCL24或IGF2（阳性对照）标记重组蛋白处理NRVM，并用EdU检测。（H，左）CCL24或IGF2（阳性对照）重组蛋白处理的NRVM上cTnT（红色）和pH3（绿色）蛋白的免疫荧光染色（n = 2）。细胞核用DAPI（蓝色）复染，比例尺100μm。（H，右）CCL24或IGF2处理组中pH3 + / cTnT +双阳性细胞比例的倍数变化，BSA为阴性对照。
5 新生儿心脏再生发育基因程序的保留
通过组学分析作者还确定了H3K27ac峰簇显著富集了细胞周期的GO条目（图4A）。转录组和表观基因组联合分析共同观察到P1心脏的活动细胞周期过程在受伤后得以保留，这表明新生儿心脏可能保留了细胞再生的潜力。接下来作者又分析了发育性基因在P1心脏中是否也活跃。作者借助ENCODE数据库比较了不同胚胎阶段（胚胎期到P1）以及8周龄小鼠心脏H3K27ac ChIP-Seq数据，确定了一组在胚胎期高度活跃但在成年心脏中沉默了的H3K27ac峰（图4B）。GO分析证实它与心脏发育过程有关。通过对比P1和P8 MI及假手术组的H3K27ac ChIP-Seq数据，发现这些基因在新生儿早期就保持活跃，并且与再生时间窗精确重叠（图4C）。其中有一个H3K27ac峰值是Tnni1内含子的增强子，这个信号在胚胎期表达显著，但8周龄的心脏不表达（图4D）。此外携带此增强子分泌基因lacZ基因的转基因小鼠胚胎，能在胚胎期11.5天时表现出对β-半乳糖苷酶的独特活性，确认此序列确实能促进心脏发育（图4E）。这些数据一起揭示了一个胚胎发育基因程序，暂时保留在新生儿心脏中使心脏再生。
图4 胚胎发育基因程序在再生心脏中保留且不会被MI诱导激活。（A）显示所有样品中与细胞周期GO条目相关的H3K27ac峰的信号强度。（B）发育中的心脏和8周龄心脏的ENCODE H3K27ac ChIP-Seq数据分析发现一个在发育中活跃的染色质区域，该染色质区域在E10，E12，E14，E16和P1处显示高H3K27ac信号。（C）H3K27ac信号表明在MI或假手术的P1或P8心脏中发育基因程序的活性。在新生儿早期阶段（P1 + 1.5和P1 + 3）保留了发育基因程序活性且不受损伤的诱导。值为归一化峰强度的z-score。（D）H3K27ac ChIP-Seq追踪Tnni1基因位点。表明不同胚胎阶段H3K27ac信号的强度。阴影区域表示基因增强子位置。（E）克隆Tnni1增强子位点并用转基因模型测试增强子活性。比例尺：左1 mm；右500 μm。LV, 左心室；OFT，右心室流出道；RA，右心房；RV，右心室
6 Igf2bp3在再生心脏中高表达促进CM增殖
为了进一步探索心脏发育和再生中已确定的发育基因（图4B），作者进一步将其重叠相关基因与P1 + 1.5 dps和P8 + 1.5 dps的RNA-Seq数据进行对比，结果发现Igf2bp3是其中之一。Igf2bp3基因座处的H3K27ac信号下降，同时H3K27me3的信号增加。重要的是Igf2bp3从P1到P8处于急剧下降状态（图5B）。IGF2BP3能稳定IGF2 mRNA的3'非翻译区来增强IGF2 mRNA的翻译，并且IGF2信号也被证实能通过CM增殖促进胚胎心脏发育。IGF2BP3也是MYC的调节剂参与细胞周期调节。因此，作者用表达IGF2BP3或TdTomato（对照）的AAV9载体（图5C），通过腹腔（i.p.）注射将Igf2bp3注射到P5的C57BL/ 6小鼠（图5D）检测IGF2BP3过表达对非再生心脏再生能力的影响。免疫组化结果显示CMs细胞中IGF2BP3高表达，在体内验证了IGF2BP3促进CM增殖（图5E和F）。为了检测IGF2BP3在心脏损伤后的增殖潜能，作者在预先（P5）给P8 MI小鼠注射AAV9-TdTomato或AAV9-Igf2bp3（图5D）。并在损伤三周后（P29）检测心脏功能（以缩短分数和射血分数表示），结果显示过表达Igf2bp3小鼠心功能明显改善（图5 G和H）。同时三色染色显示过表达Igf2bp3小鼠纤维化和心室扩张与心脏均显著减轻（图5I）。这些数据共同表明Igf2bp3在再生的心脏中有助于CM增殖和心脏再生。由于Igf2bp3是新生儿心脏中保留的发育基因的一部分，因此这些数据也提示在P1心脏可以通过利用胚胎发育基因使CM在再生过程中增殖。
图5 Igf2bp3在再生心脏中高度表达并促进CM增殖。（A）发育过程中，对照组心脏中Igf2bp3基因座的H3K27ac信号减少，H3K27me3信号信号增加。（B）心脏中Igf2bp3 mRNA表达从P1降低到P8，并且不受MI诱导（n = 3）。（C）用于过表达TdTomato（AAV9-TdTomato，对照）和Igf2bp3（AAV9-Igf2bp3）的载体示意图。ck8e，肌肉肌酸激酶启动子；P2A，猪破伤风病毒1 2A自裂解肽编码序列；SV40，猿猴病毒40 poly-A信号。（D）AAV9注射策略。C5BL6雄性小鼠的P5注射AAV9-TdTomato或AAV9-Igf2bp3。注射后P8对小鼠（随机选择）进行安乐死以进行增殖性CM的免疫组织化学（IHC）分析或qPCR分析，检查Igf2bp3过表达。其余小鼠在P8接受MI手术，在MI后3周（P29）通过超声心动图（Echo）检查其心脏功能，并对其实施安乐死进行组织学检查。（E，左）P8处AAV9-TdTomato和AAV9-Igf2bp3心脏横切面上的cTnT（紫色），Ki67（白色）和GFP（绿色）蛋白的免疫染色。细胞核用Hoechst（蓝色）复染，比例尺，50μm。（E，右）免疫免疫荧光定量分析，显示AAV9-Igf2bp3心脏与AAV9-TdTomato心脏Ki67 + / cTnT +双阳性CM百分数变化（n = 3）。（F，左）P8处AAV9-TdTomato和AAV9-Igf2bp3心脏横切面上的cTnT（紫色），pH3（白色）和GFP（绿色）蛋白的免疫染色。细胞核用Hoechst（蓝色）复染，比例尺，50μm。（F，右）免疫免疫荧光定量分析，显示AAV9-Igf2bp3心脏与AAV9-TdTomato心脏Ki67 + / cTnT +双阳性CM百分数变化（n = 3）（I）Masson的三色染色显示AAV9-Igf2bp3促进心脏再生。注射AAV9-TdTomato或AAV9-Igf2bp3的P29心脏在LAD水平结扎（0μm）以及缝线下方200、400、600和800μm处横切。FS：缩短分数，比例尺，500μm。（J）P1独特的损伤反应（差异基因表达和独特的免疫反应动力学）和再生心脏保持的特性（保留细胞周期活性和胚胎发育基因程序）。
本研究运用转录组学和表观基因组学共同分析，研究新生儿心脏再生中的机制。发现新生儿心脏在遭受损伤后的独有再生新机制，并发现胚胎调节基因可能被再生心脏利用以促进心脏修复。分析全面，为研究心脏再生机制提供了重要的数据支撑；为临床开发治疗心肌梗死等心脏损伤相关疾病奠定了分子基础。
