10X单细胞转录组的测序数据量这么少是为什么
最近读到发表在nature medicine杂志的文章《Immune profiling of human tumors identifies CD73 as a combinatorial target in glioblastoma》：
链接是：https://www.nature.com/articles/s41591-019-0694-x
它正文的 Data availability 部分就清晰地列出来了cytof数据和单细胞转录组数据存放的地方：
CyTOF data (Figs. 1, 2a,b, 3c–g and 4c,d) have been deposited with the FlowRepository (FR-FCM-Z2B3). scRNA-seq data (Figs. 2c–e and 3a) have been deposited with the Sequence Read Archive with accession number PRJNA588461.
在EBI可以下载到这个项目的10X单细胞转录组的测序数据
链接是：https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJNA588461 可以看到是7个样品的10X单细胞转录组的测序数据。每个样品是2个fq文件，所以可以毫无障碍的走我们的流程。参考我在《生信技能树》的教程：cellranger更新到4啦（全新使用教程）
目前单细胞转录组以10X公司为主流，我们也是在单细胞天地公众号详细介绍了cellranger流程，大家可以自行前往学习，如下：
单细胞实战(一)数据下载 单细胞实战(二) cell ranger使用前注意事项 单细胞实战(三) Cell Ranger使用初探 单细胞实战(四) Cell Ranger流程概览 单细胞实战(五) 理解cellranger count的结果
但是这个两年前的系列笔记是基于V2,V3版本的cellranger，目前呢它更新到了版本4，建议以我的最新版教程为准，在《生信技能树》的教程：cellranger更新到4啦（全新使用教程）
但是我在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?linkname=bioproject_sra_all&from_uid=588461看到了，它们的测序数据量介于 1~10G之间，远小于标准的100G数据量。
文章的数据分析描述如下：
These four separate count matrices were then merged into one large count matrix consisting of 13,263 cells (ranging from 2,763 to 3,666 cells per patient) by 19,187 genes. Next, the median number of unique molecules per cell was low across the four samples (1,170, 1,210, 1,468 and 1,592, respectively), resulting in a sparse data matrix, as is common to scRNA-seq data.
每个10X单细胞转录组的获得的细胞数量还算ok，基因数量也ok，但是呢，就是测序数据量有点偏低，很诡异！
文章的单细胞转录组数据分析
单细胞转录组数据分析的细节，以及背景我就不赘述了，看我在《单细胞天地》的单细胞基础10讲：
01. 上游分析流程 02.课题多少个样品，测序数据量如何 03. 过滤不合格细胞和基因（数据质控很重要） 04. 过滤线粒体核糖体基因 05. 去除细胞效应和基因效应 06.单细胞转录组数据的降维聚类分群 07.单细胞转录组数据处理之细胞亚群注释 08.把拿到的亚群进行更细致的分群 09.单细胞转录组数据处理之细胞亚群比例比较
以及各式各样的个性化汇总教程，差不多就明白了。
主要也是聚类分群
如下所示，针对的是TILs from untreated GBM tumors (n = 4)，使用的是MAGIC算法进行聚类分群，并没有采用我们主推的seurat流程。但是仍然是以不同细胞亚群的标记基因热图来进行展示，如下：
上图是：TILs from untreated GBM tumors (n = 4) were analyzed by scRNA-seq and identified using the MAGIC algorithm. Heatmap indicating the normalized expression of selected markers in leukocyte clusters identified by MAGIC.
但是，seurat实在是太全面了，仍然是推荐初学者从seurat开始认识单细胞数据分析的方方面面哈。我们《单细胞天地》的周运来大佬已经连夜翻译了他们的最新教程了，目录见：
Seurat 4.0 || 您的单细胞数据分析工具箱上新啦 Seurat 4.0 || 单细胞多模态数据整合算法WNN Seurat 4.0 || 分析scRNA和膜蛋白数据 Seurat 4.0 || WNN整合scRNA和scATAC数据 Seurat 4.0 || 单细胞PBMC多模态参考数据集
单独看 chemokine receptors基因集表达热图
前面的标记基因热图已经展示了不同的细胞亚群，接下来就是靠生物学背景了，比如，单独拿出来chemokine receptors基因集进行热图可视化，如下：
Heatmap indicating normalized expression of chemokine receptors on CD73hi macrophage clusters identified by MAGIC. 使用黑色箭头把 CD73hi myeloid 亚群标记了一下：
看基因表达量散点图
也是单细胞数据分析的常见图表之一，每个细胞首先被固定了坐标（tSNE或者umap的），然后可以在固定的坐标系对细胞属性进行不同的映射，表达量或者基因打分这样的连续性变量通常是映射为颜色深浅，点的大小。而细胞亚群这样的分类变量就映射为性状或者不同颜色。
单独看macrophage gene signature 基因集表达热图
上面的基因表达量散点图，可以看到macrophage gene signature 基因集主要是在第 3，7，14，17亚群富集着，但是它展现的是macrophage gene signature 基因集做完一个整体的打分。既然作者这样的生物学结论都是关于macrophage gene signature 基因集的，就可以单独把其全部的基因拿出来后做热图进行更具体的可视化！
图例是：CD73hi macrophage gene signature of differentially expressed genes (z-score > 3.0, 45 genes; Supplementary Table 3). The heatmap indicates the normalized expression of top differentially expressed genes in CD73hi macrophages (z-score > 2.0) identified by MAGIC.
学徒作业
当然是，根据文章的测序数据连接：https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJNA588461 ，下载7个样品的10X单细胞转录组的测序数据。每个样品是2个fq文件，走我在《生信技能树》的教程：cellranger更新到4啦（全新使用教程） ，每个样品拿到表达矩阵3个文件。
然后走下游seurat流程， 绘制上面的4个图！
写到最后
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