单细胞转录组方法篇——下
今天这一篇讲的就是基于模板转换（template-switching）原理的单细胞转录组的方法。
由于该原理所衍生出的方法较多，这里根据该原理的方法的历史发展选取每阶段代表性的方法做分享，从SMART-seq、SMART-seq2；SCRB-seq、msSCRB-seq；Drop-seq；Microwell-seq到Split-seq。
09年的基于末端加A的方法有明显的3端偏好，且11年STAT-seq虽然采用了模板转换原理，但也只是富集5端测序。
在这样的背景下，2012年，SMART-seq以扩增全长为突破口，并针对性地应用到对循环肿瘤细胞的分析中。
【SMART-seq2】
2014年，SMART-seq2被报道，作为前一代的进阶完全版，该方法主要优化了以下几点：
1. 使用相对温和的lysis buffer，来尽量达到对后续反转步骤最小的影响。
2. 使用甜菜碱（一些RNA会形成发卡或者环等二级结构使反转酶受到空间位阻可以通过甜菜碱或者海堂藻克服）提高酶的热稳定性，反转效率等。
3. 加入Mg2+以结合甜菜碱羧酸盐阴离子形成离子对成为DNA不稳定剂。
4. 10个额外的加热循环（50℃ 2min;42℃ 2min）来解开RNA二级结构。
5. oligo-dT引物与template-switching oligos（TSO）引物在设计时，3/5端处序列一样（即图中绿色部分），这样在扩增双链cDNA只需要一种引物，算是一个小技巧
6. 图中TSO引物末端不是rGrGrG，而是rGrG+G，这里+G指的是锁核酸修饰，增加核酸双链热稳定性并提高杂交的特异性，促进模板转换，笔者问了下，修饰一个碱基2OD的价格在300元左右。
7. 使用KAPA HiFi酶来放大双链cDNA，前面的推文里有介绍过Takara的Terra酶也是一款不错的扩增酶。
【SCRB-seq】
接下来要介绍的是SCRB-seq，从他的全称(Single Cell RNA Barcoding sequencing)可以知道，这个方法是一个中规中矩的使用Barcode和UMI的基于96/384孔板的较高通量的富集3端的方法。
其原理和SMART-seq一样，只不过在oligo-dT引物加上了UMI和Barcode，也就是和CEL-seq2的引物类似，可以看做是CEL-seq2同SMART-seq的结合版。
由于只有3端有Barcode的信息，因此在建库打断的时候只能扩增3端部分，也就需要自己合成特定的接头，原理图见下。
2018年Molecular crowding SCRB-seq(mcSCRB-seq)被报道于Nature communication，对于SCRB-seq做了一些列的改进，由于涉及到实验中的改进细节，我们会在后面的文章单独拉出来讲。
其实在这篇文章被报道前，也就是2017年，该作者Ziegenhain发过一篇review: Comparative analysis of single-cell RNA-sequencing methods 对比了CEL-seq，Drop-seq，SCRB-seq和SMART-seq，其中就对SCRB-seq在扩增cDNA时做了改进（使用KAPA HiFi，14年的SCRB-seq使用的是Advantage 2）。
说起作者，再提一句，就是在年中的时候发表了一篇专门针对UMI类的单细胞方法数据的分析文章：zUMIs - A fast and exible pipeline to process RNA sequencing data with UMIs 有兴趣的可以去试一试。
接下来的三个方法Drop-seq，Microwell-seq，SPLiT-seq都应用到了Split-and-pool的排列组合思想，前两者应用在Beads的合成上，而SPLiT-seq直接在细胞上进行。
这里以96孔板为例简单介绍下，这里我们准备了3轮的Split-and-pool，每一轮都会加上一段标签（Barcode或者碱基）。
第一轮我们准备了A1-A96种标签，每个孔一个，然后再pool在一起，再平均随机分配到新的96孔板里。
加第二轮标签B1-B96，由于在pool的时候是打乱了后随机分的，所以第二轮分到第一个孔里可能就是A16,A35,A73…等等。
再加上这一轮标签那第一个孔就是A16B1，A35B1，A73B1。（这里16,35,73，以及后面的数字都是笔者假设的）第三轮也依次类推，这样就有了96的3次方的可能。
【Drop-seq】
接下来就直接介绍Drop-seq：
文章里的Beads通过4个标签16轮（每一轮每一个群加一个标签）作为Barcode，在继续合成UMI时，就不能每一个群添加同样的标签，如果这样，就不会生成UMI，而是都是Barcode。
这里是每一轮每个群里面都放入4个标签（A/T/G/C），让Beads里的所伸出的类似触手的Primer随机去选择添加，这样在Beads内部的触手间就会形成差异。
有了Beads，接下来就是油包水的方法。
油包水的目的是形成一个独立的腔室，让每一个细胞同一种Beads结合，在液滴破开之前，需要完成的是Beads在腔体里，其primer触手把这一个细胞的mRNA都抓住了，也就是来自同一个细胞的mRNA都被附上了同一个barcode。
之后再讲这些beads收集起来进行RT和模板转换，最后建库。
当然，现在都用商业化的10X系统做，也就对后期的分析具有较高要求。
【Microwell-seq】
Microwell-seq于18年报道于Cell，做了小鼠的全器官单细胞图谱，今年10月Nature发表的Single-cell transcriptomics of 20 MOUSE organs creates a Tabula Muris做了补充了其他器官并且数据更为详尽，该文章用的是SMART-seq2和droplet的方法。
Microwell-seq与Drop-seq 的思想是一样的，我们把上面讲的液滴想象成微孔板里的一个微孔，就很好理解。
文中通过一定密度的细胞及beads悬液铺在微孔板上，使每个微孔里有一个细胞核和一个beads，这样在每个小单位里，细胞裂解让后beads把mRNA都抓住，再混在一起进行RT和模板转换，建库。
文章介绍了使用模具灌胶的方式获得微孔板，通过Split-and-pool方式合成barcode如下图。
这里在加标签是不再是一个一个碱基加上去，而是一段序列作为一个标签加上去，该方法和之前讲到的inDrops方法(使用体外反转录原理)在合成beads的时候一样。
Microwell-seq，在铺细胞核beads时，要在显微镜下检查控制到一个微孔只有一个细胞核beads，其工作量比较大。
【SPLiT-seq】
于是就有了下面我们讲到的廉价而又方便的SPLiT-seq。
看示意图是不是和上面Beads合成有点类似，这里直接对细胞进行Split-and-pool，由于细胞被固定和打孔，所以，一直都是一个独立的单位。
这里的原理图依旧用上图，细胞被打孔随机分到96孔板里（灰色虚线球为细胞），然后在细胞内RT，然后加上第一轮A标签，再混在一起再随机分配到96孔板里，加上第二轮B标签，再混在一起随机分配到96孔板加C标签。
最后进行lysis和模板转换。
这个方法巧妙的将单细胞转化为Bulk细胞的操作，并且对设备仪器等需求低。笔者根据给出的序列信息整理了该方法的流程，有需要的可以看一看。
-conclusion-
讲到这里，我们来总结一下。
模板转化原理经历了从单个tube到96/384孔板到Drop在到微孔的反应腔体变化，单个Tube细胞单独反转单独建库，96/384孔板细胞单独反转群体建库。
而Drop和微孔中，细胞群体反转群体建库，SPLiT-seq虽然也是群体反转群体建库，但其并非通过Beads抓取单个细胞中的mRNA，而是将固定的细胞作为个体进行加Barcode。
然后我们再来谈谈成本问题，单细胞的成本花费主要集中在RT酶和建库上，因此，群体的反转和建库将大大降低成本。
接下来我们再总结一下各个方法的关系，这里我们做以下假设：
单细胞隔离的方法有：
a：口吸管
b：FACS 96/384孔板
c：Microwell
d：Droplet
单细胞Primer类型：
A：oligo-dT
B：带T7
C：带UMI
D：带Barcode
单细胞RNA到cDNA的原理有：
X：末端加A/C法
Y：IVT法
Z：模板转换法
于是我们就有这样的组合（a和b有时通用）比如：
aAX就是09年的方法和Quartz-seq
bACDX就是Quartz-seq2
bABCDY就是CEL-seq2
bACDZ就是SCRB-seq和STAT-seq
dACDY就是inDrop-seq
dACDZ就是Drop-seq
cACDZ就是Miocell-seq
也有一些排列组合没有报道，比如cACDX、cACDY等等。
也就是不同的排列组合会有不同的方法出现，如果单细胞隔离的方法出现新的，那就会有新的排列组合！
1. Daniel Ramsköld, Luo S , Wang Y C , et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells[J]. Nature Biotechnology, 2012, 30(8):777-782.
2. Picelli S , Faridani O R , Åsa K Björklund, et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J]. Nature Protocols.
3. Petersen M , Wengel J . LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics[J]. Trends in Biotechnology, 2003, 21(2):74-81.
4. Semrau S , Goldmann J E , Soumillon M , et al. Dynamics of lineage commitment revealed by single-cell transcriptomics of differentiating embryonic stem cells[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):1096.
5. Bagnoli J W , Christoph Z , Aleksandar J , et al. Sensitive and powerful single-cell RNA sequencing using mcSCRB-seq[J]. Nature Communications, 2018, 9(1):2937-.
6. Swati P , Christoph Z , Beate V , et al. zUMIs - A fast and flexible pipeline to process RNA sequencing data with UMIs[J]. GigaScience, 2018, 7(6).
7. Ziegenhain C , Vieth B , Parekh S , et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods[J]. Molecular Cell, 2017, 65(4):631-643.e4.
8. Macosko E , Basu A , Satija R , et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets[J]. Cell, 2015, 161(5):1202-1214.
9. Han X , Wang R , Zhou Y , et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq[J]. Cell, 2018, 172(5):1091.
10. Rosenberg A B , Roco C M , Muscat R A , et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding[J]. Science, 2018:eaam8999.
11. Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris[J]. Nature, 2018, 562(7727): 367.