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在pubmed搜索ceRNA，发现很多实验类的文章，做了很多内容，但是只发了2-3分，所以今天想和大家一起学习2021年1月发表于Molecular Therapy Nucleic Acid的ceRNA的肿瘤生信文章，看看这篇纯生信的文章是如何做到7+的水平的。
文章题目
Comprehensive analysis to identify DLEU2L/TAOK1 axis as a prognostic biomarker in hepatocellular carcinoma
期刊简介
题目：Comprehensive analysis to identify DLEU2L/TAOK1 axis as a prognostic biomarker in hepatocellular carcinoma疾病：肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）分析策略：差异表达 + 功能聚类 + 临床意义 + 交互网络 + 甲基化分析 + 免疫分析（https://www.xiantao.love/products）（https://www.proteinatlas.org/）（http://www.cbioportal.org/）（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/）（http://microrna.gr/tarbase/）（http://www.targetscan.org/vert_71/）（http://ualcan.path.uab.edu/）◆ DiseaseMeth version 2.0数据库(http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/diseasemeth/)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)总体来看，作者先从TCGA数据库中挑出HCC（肝细胞肝癌）的样本，并对肿瘤vs正常以及PTEN高低表达进行差异分析，筛选出差异表达的lncRNA、miRNA、mRNA（图2和图3），构建ceRNA调控网络（图4），并对此ceRNA调控网络进行富集分析（图4）、生存分析（图6）、亚细胞定位分析（图7）、分子相关性分析（图7）、甲基化分析（图8）、免疫分析（图9）等，涉及到差异表达（挑），功能聚类（圈），交互网络（联），临床意义（靠）的各个方面，内容丰富饱满，非常值得学习借鉴。详细解读如下 ▼本文一共9个主图，6个附表，7个附图，很多附图表和主图的绘制方法类似，就不再重复，这里只复现了主图和有代表性的附图表，现在就开始吧。流程图用PPT、思维导图软件、photoshop等都能实现，这里不再赘述。图2、PTEN在人类肝细胞癌（HCC）中的抑癌作用▼进入HPA数据库：https://www.proteinatlas.org/往下拉，就能看见【RNA EXPRESSION OVERVIEW】,截图保存即可。▼（注：作者这里犯了个小错误，此图是正常组织的PTEN表达情况，而被作者标注成了pan-cancer了。）（注：作者这里也标注错了，附图1应该是PTEN在泛癌中的表达）仙桃学术的生信工具不仅能一键完成此图，还有非配对样本和配对样本的对比，一起来看看吧～进入仙桃学术生信工具：https://www.xiantao.love/products（注：免费版和基础版都可以进行统计和可视化，由于高级版功能最全，这里选择高级版作为范例）【分析工具】 → 【表达差异（挑）】 → 【非配对样本】 → 【泛癌】 → 输入分子【PTEN】 → 调整图片颜色和大小 → 【确认】▼这里就可以看到PTEN在33种肿瘤的非配对样本中的表达情况了。此时即“保存结果”到云端的历史记录，也可用其他格式保存到电脑中。▼（小贴士：建议后续需要拼图的图片均选择“保存结果”，这样可将保存的结果直接在“拼图工具”中进行拼图，省去了后面上传图片的步骤，咱们能偷懒就尽量偷懒，把时间花在更必要的地方，对吧~）【配对样本】 → 调整图片颜色和大小 → 【确认】▼（小贴士：现在仙桃学术的记忆力变好的哟，上次搜索的内容，比如【泛癌】、【PTEN】都记在仙桃的小脑袋瓜里，下次检索的时候，只需要再看看是不是自己需要的疾病和分子，更换分析方法就好啦~ 懒癌星人的福音哈哈~）换个图片，继续【图片另存为】，完成后可点击左上角的x把图片关闭。▼肿瘤样本用类似的方法，【PATHOLOGY】 → 【CANCER】→ 【LIVER CANCER】▼图2C PTEN高低表达的Kaplan-Meier生存曲线▼仍然可在仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products）中完成。【临床意义（靠）】 → 调整预后参数 → 【确认】 → 【保存结果】或【下载图片】▼图2D cBioPortal的OncoPrint图显示TCGA-HCC中PTEN基因组改变的分布 ▼进入cBioPortal主页（http://www.cbioportal.org/）选择【Liver】 → 找到【Liver Hepatocellular Carcinoma】 → 点击【Query By Gene】▼（小贴士：这里有很多【Liver Hepatocellular Carcinoma】，可以根据需要选择一个或多个研究数据，这里根据原文选择了TCGA数据，一般来说，选择CNS级的数据更可靠哦〜）选择【Mutations】和【Putative copy-number alterations from GISTIC】 → 输入目的基因【PTEN】 → 【Submit Query】▼图2E cBioPortal中PTEN拷贝数与mRNA表达之间的关联 ▼接着上一步，【Plots】 → 【Download】▼图2F cBioPortal中PTEN拷贝数与mRNA表达之间的相关图▼接着上一步，选择【Log2 copy-number values】→ 取消【Mutation Type】和【Copy Number】前的选择 → 在【Show Regression Line】前打勾 → 【Download】▼还是在仙桃学术的生信工具（https://www.xiantao.love/products）点击【基础绘图】 → 点击【上传图片】 → 选择图片并上传 → 【确认】 →【保存结果】至云端。除了在仙桃中完成并保存的图片，其他图片都逐一上传。▼将所有图片都上传并保存至云端以后，打开【拼图工具】 → 拖拽图片至空白处 → 调整图片大小和位置 → 调整【ABC标注】格式。▼这就是完成拼图的结果了，全部自动标注好了ABCD呢〜▼图3 HCC样本中PTEN高低表达之间的差异lncRNA、DEmiRNA、DEmRNA的火山图和热图▼在仙桃学术中【生信工具】 → 【分析工具】 → 【表达差异（挑）】 → 【单基因差异分析】 → 选择【肝细胞肝癌】 → 分子输入【PTEN】 → 【确认】 ▼（小贴士：此分析所需时间略长，请耐心等待哟〜 待会儿你就会发现，等待非常值得〜）在【历史记录】中可以看到分析的状态仍然是【执行中】▼待状态变为【完成】时，即可下载结果了。这里我们需要【Excel表格下载】和【差异lncRNA】▼【表达差异（挑）】 → 【火山图】 → 上传刚刚下载的【差异lncRNA】 → 选择【基本参数】（文章中用的是logFC >0.5, P<0.05） → 输入标题【lncRNA】→ 【确认】 → 【保存结果】或下载图片▼（小贴士：其实火山图的示例数据中只有【gene_name】、【logFC】、【adjP】，不小心发现其实可以将上一步下载的结果直接上传，不用麻烦的整理数据，就迫不及待的把这个偷懒的小招妙告诉你萌啦～）点击【gene_biotype】旁边的小三角 → 选择【miRNA】 → 【确定】▼这样就将所有的miRNA筛选出来了，将所有筛选出的数据复制粘贴到一个新的Excel文件，取名“miRNA”,保存。▼用同样的方法筛选【gene_biotype】为【protein_coding】的行，保存为“mRNA”文件。▼按照lncRNA的方法，分别上传文件，就能得到相应的火山图了。（小贴士：其实用筛选miRNA和mRNA的方法来筛选lncRNA，得到的结果和直接下载的结果是一模一样的，大家有兴趣可以尝试一下~）图3D-E 15个差异最大的lncRNA、miRNA、mRNA的热图 ▼打开保存好的差异miRNA的Excel文件，新建一列【abslogFC】 → 下一行写公式【=abs()】 → 用鼠标点一下【log2FoldChange】下的第一个数字 → 按回车键 ▼把鼠标放在这个数字的右下方的绿点处，等鼠标从╬变成＋,双击鼠标 ▼【abslogFC】这一列就自动算出所有【log2FoldChange】的绝对值了▼【筛选】 → 【pvalue】旁边的小三角 → 【数字筛选】 → 【小于】 ▼（小贴士：一般选择【padj】,就是校正后的p值，但因此数据【padj】缺失值较多，所以选择了【pvalue】，所以具体情况要具体分析哦~）选中【abslogFC】列 → 【筛选】 → 【降序】 ▼这样，就选出了P<0.05的行，并且按照logFC的绝对值从大到小进行了排列。现在只用选中前15个基因名，复制就好了▼进入仙桃学术生信分析工具 【交互网络（联）】 → 【单基因共表达】 → 选择【肝细胞肝癌】 → 输入目的分子【PTEN】 → 【标题文本】中输入【miRNA】 → 将上一步筛选出的相关基因粘贴至【分子列表】 → 【确认】 → 【保存结果】或【下载结果】▼（小贴士：如果直接从TCGA数据库下载数据画热图，需要经过数据下载、合并、清洗、基因名称转换、寻找相关基因、排序、数据整理、绘制热图等复杂的步骤和程序，而在仙桃学术不仅能轻松搞定，还能获取更加丰富的信息哦~）用同样的方法画出其他图片，并拼图，即可得到以下结果▼图4 lnRNA-miRNA-mRNA调控网络的构建和功能富集分析▼此图主要是在Metascape数据库（http://metascape.org/）中完成的。（小贴士：虽然仙桃学术也能做相应分析，但是目前只能分析700个基因，对于此次分析有点容量不足。仙桃学术的技术小哥哥无所不能，所以大家有什么需求，直接在本文下方或者公众号里许愿，大家的呼声高了，愿望就能早点实现啦~ 顺便也给技术小哥哥一点压力，哈哈哈哈~）将所有的差异lncRNA+miRNA+mRNA名字都粘贴到【list】 → 【Submit】 → 选择【H.sapiens】(代表人类) → 【Expression Analysis】 → 等待一段时间，直到下方100分 →点击【Analysis Report Page】▼（小贴士：这里可以上传文件的，也许是网速原因，多次尝试上传文件都没有成功，所以最终选择上传list，网速好的小伙伴们也可以试试直接上传文件哦~）图5 TCGA-HCC数据集中ceRNA调控网络的13种Hub-RNA表达模式的分布▼【表达差异（挑）】 → 【非配对样本】 → 【TCGA-LIHC】 → 【点图】 → 输入目的分子，如【DLEU2L】 → 【统计分析】选择【p=科学计数】 → 【确认】 → 【保存结果】或下载 ▼每个小图的做法都类似，只需更改目的分子的名字就好了。每个小图的做法也都类似，只需更改目的分子的名字就好了。【分析工具】 → 【临床意义（靠）】 → 【KM曲线图】 → 【TCGA-LIHC】 → 输入目的分子，如【DLEU2L】 → 【确认】 → 【保存结果】或下载 ▼图7A 三种lncRNA（DLEU2L，FAM99A和ARRDC1-AS1）的细胞定位▼进入LNCipedia（https://lncipedia.org/）主页 → 输入目的分子，如【DLEU2L】 → 搜索 ▼进入lncLocator（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/）,将刚刚复制的序列粘贴进来 → 【submit】 ▼页面最下方即可得到lncRNA在细胞中的分布比例 ▼图7C 用TarBase预测DLEU2L与miR-99a-5p和miR-100-5p的靶位点之间的碱基配对，用TargetScan预测TAOK1 3'UTR与miR-99a-5p和miR-100-5p的靶位点之间的碱基配对▼TarBase数据库（http://microrna.gr/tarbase/） → 输入目的分子，如【DLEU2L】 → 选择【Homo sapiens】 → 【Apply】即可得到与DLEU2L结合的miRNA分子▼TargetScan数据库（http://www.targetscan.org/vert_71/）选择【Human】 → 输入目的分子，如【TAOK1】 → 【Submit】▼找到【Human】 → 下方即为【TAOK1】与miRNA的结合位点▼图7D 肝癌中四个预测性RNA之间及其与PTEN的相关性分析▼回到仙桃学术生信工具（https://www.xiantao.love/products） → 【交互网络（联）】 → 【散点图】 → 选择【肝细胞肝癌】 → 基因A输入【PTEN】 → 基因B输入【DLEU2L】 → 【确认】 → 【保存结果】▼好吧，图8A还没有找到在线的工具可以完成，只能用R语言了，希望仙桃学术的技术小哥哥能早点搞定~进入UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/） → 【TCGA analysis】▼输入【TAOK1】 → 选择【Liver hepatocellular carcinoma】 → 【Explore】▼图8C 使用DiseaseMeth 2.0版评估甲基化▼DiseaseMeth version 2.0 (http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/diseasemeth/) → 【Analyze】▼选择【Liver hepatocellular carcinoma[LIHC]】 → 输入【TAOK1】 → 选择【Array-based technology】 → 【Analysis】▼选择【NM-025142】 → 【Analysis】▼选择【chr17:277_5942-27718446】 → 【Analysis】▼图8D MEXPRESS数据库中显示TAOK1的DNA序列与基因表达的甲基化位点▼MEXPRESS数据库(https://mexpress.be) → 输入【TAOK1】 → 选择【LIHC】 → 【PLOT】 → 出现图片后【Download】即可 ▼图9 肝癌组织中TAOK1表达与免疫浸润的相关性分析▼图9A HCC中TAOK1基因拷贝数与免疫细胞浸润水平之间的关联▼TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/) → 【SCNA】 → 选择【LIHC】 → 输入【TAOK1】 → 【Submit】 → 出现图片后下载即可 ▼图9B TAOK1表达与HCC免疫浸润水平的相关性▼TIMER数据库 → 【Gene】 → 输入【TAOK1】 → 选择【LIHC】 → 【Submit】 → 出现图片后下载即可 ▼TIMER数据库 → 【Survival】 → 选择【LIHC】 → 输入【TAOK1】 → 【Plot KM Curve】 → 出现图片后下载即可 ▼探索基因间相互作用和功能，除了string还有更友好的它！绝了！9+纯生信文章，我用15分钟零代码教你复现！老底儿都没了（附详细操作教程）
