科研 | 南农韦中组Environ. Microbiol.: 番茄全生育期根际细菌群落功能多样性及病原菌入侵抗性的建立
编译：LorMe，编辑：小菌菌、江舜尧。
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根际微生物群落在组成和功能上具有高度的变异，那么究竟哪些过程驱动了功能微生物的组装？本研究具体地展示了根际微生物区系的动态变化及其塑造的关键生态过程。
本研究利用高通量测序和分离株表型相结合的方法，展示了根际微生物按照生态演替模式自发组装成高抑病性微生物区系的过程。研究发现，根际微生物聚集是一个动态过程，从植物生长前期根际具有随机资源重叠物种的先锋群落到植物生长后期根际的高密度、功能互补的顶极群落。通过测定从不同植物生长阶段分离出的细菌菌株的特征并将其与细菌群落抵抗病原菌入侵能力相关联，证明了高功能多样性的顶极微生物群落能够更好地抵抗细菌病原体的入侵。共生物种的资源互补增加了他们抵抗病原菌入侵的能力，这种演替对根际微生物群落功能有着深远的影响。这项研究证明了生态位划分和群落演替是驱动根际微生物群落功能的重要因素，强调了幼苗对疾病敏感的原因，并提供了可加快植物健康相关功能微生物组合的理论框架。
论文ID
原名：Rhizosphere microbiome functional diversity and pathogen invasion resistance build up during plant development
译名：“循序渐进”，番茄全生育期根际细菌群落功能多样性及病原菌入侵抗性的建立
期刊：Environmental Microbiology
IF：5.147
发表时间：2020.05
通信作者：韦中
第一作者：胡洁
通信作者单位：南京农业大学资源与环境学院
实验设计
1 供试材料
供试土传病原菌采用mCherry标记的青枯雷尔氏菌QL-Rs1115菌株；供试植物为番茄栽培品种“合作903”，购自江苏省农科院；供试土壤为江苏宜兴采集的沙质土壤。
2 根际土壤采集
土壤过筛并混匀后用于盆栽试验，番茄种子表面灭菌后水琼脂发芽3天转移到育苗基质。在番茄三叶期（播种后12天）将幼苗移植到盆中。移植后的0天（非根际土），5天（幼苗期），35天（开花期）和60天（结果期）进行了破坏性采样（图1），在每个生育期采集三株番茄植株采集其根际土壤。
图1 不同采样时期番茄生长情况
3 分析手段和方法
1. 采用高通量测序技术及细菌菌株分离相结合的方法。根际土壤提取DNA后使用定量PCR测定根际细菌总量，并进行16S rRNA高通量测序；使用稀释涂布法在1/3 TSA琼脂板上分离土体土壤和根际土壤中的细菌菌株，并根据16S rRNA基因测序结果进行菌种比对鉴定（图2）；
2. 将fastree数据在iTOL网站中进行可视化，并将培养分离细菌的16S rRNA基因测序序列与高通量测序所得的OTU代表序列相匹配。
3. 分离菌碳资源利用模式：评估37种代表番茄根系分泌物的不同碳源上所有384株细菌的资源利用模式。基于定量底物利用指标的功能多样性表征群落水平资源利用能力。
4. 菌株非生物抗性试验：评估了在有限的资源供应、氧化胁迫和高盐胁迫下，每一株菌株的生长能力，以此作为它们应对次优生长条件的潜力指标。（10%的TSB培养基作为有限的资源供应，全营养TSB培养基添加1 mM H2O2作为氧化胁迫，全营养TSB培养基添加200 mM NaCl作为高盐胁迫）。
5. 拮抗次级代谢产物的产生：通过测试不同细菌菌株无菌上清液对Ralstonia solanacearumQL-Rs1115生长的抑制能力。重组菌群的病原入侵抗性：将从每株植物根际分离出的32株细菌重新组合成菌群，测定它们抵抗青枯菌入侵的能力。
图2 试验设计流程
结果与讨论
1. 细菌群落密度、结构和多样性的动态变化
植株根际微生物群落总细菌密度随时间而增加，虽然幼苗期根际中的细菌数量只略高于土体土壤中的细菌数量，但结果期根际细菌数量却增加了十倍(F3,8=85.73,p<0.0001,图3A)。根际土壤的细菌多样性低于土体土壤中的细菌多样性(F3,8=4.38,p=0.0457,图3B)。在所有生长期（幼苗，开花和结果；F3,8=2.29,p=0.002,图3C），土体土壤的微生物群落结构与根际土壤不同。另一方面，开花期与结果期的根际微生物群落非常相似（图3C）。这些结果表明，根际微生物群落的细菌丰度，多样性和结构受到植物发育的影响。
土体土壤和根际土壤中24种最丰富的根际细菌种类的相对丰度有显着差异（图3D）。一般而言，变形菌、拟杆菌、硬毛菌和疣状菌的相对丰度在土体土壤微生物组中比根际微生物群落分布更均匀（图3D）。至关重要的是与土体土壤微生物组相比，苗期根际微生物群落中拟杆菌的相对丰度增加，而植物发育过程中疣状菌的相对丰度降低（图3D）。在土体土壤和不同植物生长期的根际中，其他20个细菌门的相对丰度未见变化（图3D）。
土体土壤和不同生长期的根际微生物群落共有3187个OTU（图3E）。开花期根际中包含了更多特有的OTU（1875），甚至比土体土壤中独特的OTU（1430）还要多。与开花期和结果期相比，幼苗期根际与土体土壤共享更多相同的OTU（719）（图3E）。
2. 可培养细菌分离株鉴定
从不同生长期番茄植株的根际中分离并鉴定了331个可培养细菌，每个生长期大约有90种，分为4个门（变形杆菌，硬毛菌，拟杆菌，放线菌）（图4A和4B），以变形杆菌(52.3％)为主，其次是固溶菌（35.6%），放线菌（8.2%）和拟杆菌（3.6%）。分离出的细菌隶属于35个不同属（图4A）。从开花期和结果期根际分离的细菌更集中在同一生长期分离的细菌中，而从土体土壤和幼苗期根际分离的细菌则更多地分布在发育树的不同分支中（图4A）。从根际中分离培养的变形杆菌和放线菌的比例随着植物的生长而增加，而拟杆菌属在植物生长的早期相对丰度最大（图4B）。
总体而言，在331个细菌分离株中，有298个（90.0％）细菌分离株聚集在根际微生物群落的60个OTU上（图4C），只有33个（10.0％）分离株无法与任何根际微生物群落的代表序列匹配。共有全部60个OTU（7938个OTU）（图4C）出现在根际微生物群落中。由此可以得出的结论，细菌分离株可以代表根际微生物群落。
图4 在不同植物生长阶段从土体土壤和番茄根际土壤中分离出的可培养细菌的分类多样性和功能多样性。A：所有分离株的系统发育树，图例显示了排在前10位的丰富属。第一个带显示所有植物的生长阶段，第二个带指示所有分离株的属水平隶属关系，第三个带指示门属水平隶属关系所有的分离株。B：通过16S rRNA基因测序确定的被分析菌群的门分类学隶属关系。 C：将分离的菌株映射到根际微生物组OUT上，上方的条形图表示根际微生物组中7938个OTU的相对丰度，灰色条显示800个最丰富的OTU。深灰色的条表示丰富的OTU（相对丰度> 0.1％），蓝色的条表示存在至少一种分离株的OTU。下方的倒置条形图表示在根际中映射到OUT的分离细菌的数量，条带阴影与上图相同，以指示每个OTU的相对丰度，绿色虚线矩形内的条形表示这些分离株映射了不属于前800个丰富OTU的OTU。
3. 细菌群落功能多样性与抗逆反应的生活史策略转变
所有细菌都可以在一个或多个供试根际碳源上生长。由同一植物收集的资源利用模式不同的分离株,可培养的细菌群落功能多样性随着植物生长增加，从幼苗期的低功能多样性至花期最高，而在果期阶段多样性则略有减少（图5A）。基于每种植物样品分析的32个菌群的功能多样性随着植物生长而增加，表明在实验的后期，分离的菌群在底物使用方面表现出更高的生态位互补性（图5A）。
图5 根系分离细菌在植物生长阶段生活史策略变化。A：在代表性根际碳源上测得的单个菌株生长模式的功能多样性基础。在每个时间点分析了三个独立的土壤样品，每个样品有32个菌落。B-D：番茄不同生长阶段根际分离株非生物抗逆性，抗逆性通过各分离株在液体培养基中的相对生长度来评估。试验共评估了三种应激源：低资源可利用度（培养基浓度降低10倍）、氧化应激（1mM H2O2）和高盐度（200mM NaCl）。每个点代表一个分离株。
花期及结果期的分离株细菌非生物胁迫耐受性比土体土壤或苗期的分离株高。从结果期土壤样品分离的细菌应对有限资源的表现最佳（图5B），而花期土壤样品分离的细菌具有最强抗氧化和耐盐性（图5C-D）。结果期根际养分限制耐性变异系数显著低于其他生长阶段，而养分限制耐性变异系数是指示同一株植株上耐感菌和耐感菌共生的指标，这表明，从根际微生物组分离出的菌株具有相似的抗逆性。
4. 根际细菌对青枯菌的拮抗作用
从根际中分离出的所有细菌及从土体土壤中分离的大多数细菌，都对土传病原青枯菌表现出一定程度的拮抗作用。细菌对青枯菌的拮抗作用随着植物的生长而增加，在结果期达到最高水平（图6A）。研究发现所筛选分离的细菌拮抗活性发生剧烈变化。这种异质性在土体土壤中最明显，在幼苗期根际生较为适中，并随植物生长而再次增加（图6B）。土壤的异质性可以解释土体土壤分离菌具有较高的变异水平。随着植物的生长其根际细菌对青枯菌拮抗能力的变异系数不断增加，表明植物幼嫩根系周围可能具有有利于物种投入相对较少的能量来生产有毒的次生代谢产物的条件，而在植物生长后期，具有多种生活史策略的细菌更有可能会共存。
图6 在不同生长阶段从番茄根际土壤中分离的细菌上清液的活性抑制能力。A：利用上清液对土传病原青枯菌进行了测试，抑制能力定义为与对照相比病原菌生长的减少量。B：分析每个样品的变异系数。高变异系数表明拮抗和非拮抗分离株并存。每个点代表一株植物的变异系数。
5. 重组微生物群落抵抗青枯菌入侵的能力
为测试资源利用及拮抗模式是否反应在入侵性中，研究在共培养实验中评估了每个植物中32个分离株的重组抵抗青枯菌入侵的能力。相比对照，虽然所有组合在不同阶段抗入侵效果不同，但都能抑制病原菌生长（图7）。花期分离株重组后抑制病原菌的效果最好。
图7 重组微生物组的群落水平病原抑制能力。把样品中分离出的32种细菌分离株重组，用土传病原青枯菌进行入侵。与病原菌单独生长的对照处理相比，将病原菌与重组的微生物组共培养时，以病原体生长的相对减少代表对病原菌的抑制能力。
由于开花和结果期群落表现出较高的分类学多样性、功能多样性、抗逆性和对病原菌的毒性，研究测试了能否根据这四个参数预测群落对病原菌的抑制作用。研究发现依据资源利用率计算的每个组合的功能多样性是抑病水平的最佳预测因子（表1）。相反，分类学多样性、抗逆多样性及单个物种平均抑制活性是抑病水平较差的预测因子。这表明与通常假设相反，入侵能力可能主要被资源竞争驱动，而非拮抗竞争。
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Factors\Function |
Pathogen suppression |
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df |
p-value |
F |
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Taxonomic diversity |
1 |
0.2491 |
1.58 |
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Functional diversity |
1 |
0.0317 |
7.16 |
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Stability under stress |
1 |
0.1163 |
3.21 |
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Antagonistic competition ability |
1 |
0.3682 |
0.93 |
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Residuals |
7 |
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Model summary |
R2 = 0.45; AIC = -60.85 |
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总结
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