重磅综述 | Nature：微生物的氮循环网络
编译：阿昊，编辑：小菌菌、江舜尧。
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氮是所有生物体的重要组成部分，也是地球上限制生命的主要营养元素。到目前为止，大气中的氮是最大的氮库，但大多数生物只能依赖于生物可利用的氮形式来生长，如铵和硝酸盐，而可被获取的氮含量取决于复杂微生物组成的网络。本文综述了近期的研究进展包括：微生物氮循环网络，新的固氮过程、潜在生化途径、相关微生物、环境影响和工业应用。
论文ID
原名：The microbial nitrogen-cycling network
译名：微生物的氮循环网络
期刊：Nature Review Microbiology
IF：41.577
发表时间：2018.2.5
通信作者：Marcel M. M. Kuypers
通信作者单位：德国马普海洋微生物研究所
主要内容
氮是所有生物体的必需元素，同时也是蛋白质和核酸等关键细胞成分生物合成所必需的。大气中的氮气是可及态氮的最大存量。生物的生长必须依赖更具活性的氮，如铵和硝酸盐。这种生物可利用的氮在许多环境中是罕见的，生长限制性营养素主要由可以改变氮状态的微生物所控制。人类活动对生物可利用的氮含量产生了深远的影响，这主要是由于工业氮肥的高投入。目前，约50%的人口的粮食生产依赖于工业肥料。化肥的使用和豆科植物的种植使陆地和海洋生态系统的氮输入几乎翻了一番。为了预测这一输入的后果，迫切需要了解微生物氮转化的基本机制。
Box1.生物地球化学氮循环：全球库存、过程和流动
图1.微生物对氮化合物的转化
1 氮转化反应
大气中的氮气是最大的可自由获取氮的储层，但它在生物学上仅对携带固氮酶或金属酶的微生物有效，因此可以将二氮固定在氨中。固氮酶广泛存在于细菌和古细菌中，为它们在生物可用态氮耗尽的环境中具有竞争优势。有三种不同类型的固氮酶包括：铁（FeFe）、钒铁（VFe）和钼铁（MoFe）固氮酶。它们具有相似的序列、结构和功能，但它们的金属负载不同。所有固氮酶由两种成分组成（图2a）。anfDGK、vnfDGK或nifDK编码活性中心分别含有铁、钒或钼的固氮酶的催化成分。NifH作为固氮检测的基因标记环境中的微生物。土壤固氮菌vinelandii编码所有三种固氮酶，而其他微生物，如海洋固氮菌Trichodesmiumspp，只有MoFe固氮酶。在固氮过程中，电子载体（如铁氧还蛋白）首先降低铁蛋白价态，随后降低催化成分价态。这就需要铁和催化蛋白解离和重新结合。每固定一个氮分子，消耗16个ATP分子。额外的生物能源成本来自于生产强有力的还原剂，如铁氧还蛋白，以及保护不稳定的含氧固氮。
由于氧暴露使固氮酶失活，产氧的光养生物，如毛苔藓属植物、番红花属植物和结瘤属植物。即使是生活在有毒环境中的非光合生物体，也需要一些机制，如增加有氧呼吸、通过超氧化物歧化酶解毒和固氮酶结构变化，以保护其固氮酶免受氧化。最近，一种不寻常的固氮酶在固氮过程中存在着完全不同的途径。虽然没有发现固氮真核生物，但许多固氮微生物与真核生物共生。单细胞蓝藻'地中海假丝酵母菌’（UCYN-A），与小型单细胞单体藻类（Braarudosphaerabigelowii）是目前应用最广泛的固氮微生物之一，在海洋固氮中起着关键作用。共生固氮微生物也是白蚁等动物肠道微生物群的一部分，可在双壳类动物的特殊细菌细胞中发现。此外，根瘤菌生活在作物豆科植物的特殊根瘤中，如苜蓿、豆类、豌豆和大豆，它们提供全球20%的食物蛋白质。
所有已知的好氧氨氧化细菌和古细菌都使用氨单加氧酶（AMO）将氨氧化为羟胺，从而使其激活。大多数氨氧化细菌属于β-变形菌（Betaproteobacteria）和丙型变形菌纲（Gammaproteobacteria）两类，是将氨氧化为亚硝酸盐的化学自养生物。在几乎所有的环境中都能找到它们，包括施肥土壤和废水处理厂。属于古生菌，也可以通过将氨氧化为亚硝酸盐进行化学自养。他们的发现揭开了海洋中罕见的氨氧化剂的神秘面纱。在一些砂质和粉质粘土土壤中，Thaumarcheota比细菌更为丰富。此外，嗜酸氨氧化古生菌'Devanatara’的分离推翻了通常的假设，即由于氨的有效性低，在低pH下不能发生化学自养氨氧化。许多氨氧化剂，如亚硝基螺菌和亚硝基螺菌，也可以降解有机氮化合物，例如，用脲酶水解尿素来产生额外的氨。古细菌亚硝基球藻也可以通过氰合酶水解氰酸盐来产生氨。最近，在亚硝基螺属的成员中也发现了氨的氧化能力。这些将氨氧化为硝酸盐的细菌的发现驳斥了氨和亚硝酸盐的氧化需要两类不同微生物的教条。执行Comamox过程的细菌，如'Candidanitrifying helicobacter（念珠菌硝化螺旋菌）'，似乎很好地适应氨有限的环境，并能超过大多数培养的氨氧化微生物氨。氨水培养基中亚硝酸盐的瞬时积累表明，它们比亚硝酸盐更有效地氧化氨水。我们假设在氨限制条件下，执行Comammox工艺的细菌将氨氧化为硝酸盐，在氧限制条件下，执行部分氨氧化为亚硝酸盐。AMO与甲烷单加氧酶（MMO）密切相关，MMO存在于伽马蛋白杆菌和候选菌门NC10中。MMO也可以将氨氧化为羟胺（图1）。类似地，AMO也可以氧化甲烷，但效率低于MMO。有趣的是，在发现之前，已经在环境中（例如地下水中）检测到执行Comammox过程的细菌的amo序列，但错误地将其指定为丝状甲烷氧化多孢菌的微粒MMO（pmo）基因。最近对多孢囊圆线虫的研究表明，它们实际上含有典型的Gammaprotobacterial pmo，而不是amo。
氨的好氧氧化制羟胺是一种非能量反应。因此，所有好氧氨氧化剂都通过进一步氧化羟胺来节约能源。研究表明，好氧氨氧化菌利用八羟胺氧化还原酶（HAO）将羟胺氧化为亚硝酸盐。最近，有研究表明，HAO的产物不是亚硝酸盐，而是一氧化氮，后者被未知的酶进一步氧化为亚硝酸盐。虽然催化反应的酶尚未被确定，但有人认为含铜亚硝酸盐还原酶（Cu-NIR）可以催化it7。所有氨氧化细菌，包括新发现的能将氨氧化为硝酸盐的硝化螺旋菌，都含有AMO和HAO。相比之下，已知的氨氧化古细菌并不编码HAO，而古细菌的酶负责 羟胺氧化还不清楚。HAO属于一个八氢蛋白家族（图2b）。厌氧氨氧化细菌的基因组编码大约10个类HAO蛋白，其中一个还将羟胺氧化为一氧化氮。在厌氧氨氧化细菌中，这种羟胺氧化酶（HOX）回收羟胺，羟胺从肼合酶（HZ）中漏出，见下文。甲烷氧化细菌也会产生羟胺，这是由于它们的非特异性氨氧化活性（见上文）。目前，还不清楚这种反应是否直接产生能量。
图2. 酶催化四个关键氮循环反应。
1.4 亚硝酸盐氧化成硝酸盐
亚硝酸盐氧化是产生硝酸盐的主要生化途径，是由亚硝酸盐氧化还原酶（NXR）催化的。NXR由好氧亚硝酸盐氧化细菌（α蛋白细菌、β蛋白杆菌、γ蛋白杆菌、和硝化螺旋菌门的成员）、无氧光养菌（例如Rhodopseudomonassp.LQ17）。好氧亚硝酸盐氧化菌将NXR氧化亚硝酸盐直接耦合到节能上，而厌氧亚硝酸盐氧化菌则没有。Rhodopseudomonassp.LQ17可以通过直接将亚硝酸盐与光合细菌偶联而使其厌氧氧化。此外，厌氧氨氧化细菌可能将厌氧亚硝酸盐氧化耦合到碳固定。亚硝酸盐氧化细菌在代谢上有多种用途，可以在亚硝酸盐以外的基质上生长。事实上，硝基螺氨氧化氨生成硝酸盐。硝化螺旋菌在氢气和有机酸的作用下有氧生长，同时吸入硝酸盐。这些亚硝酸盐氧化细菌中的硝酸盐还原也被NXR催化。农业土壤中亚硝酸盐和氨氧化微生物的协同作用将氮肥转化为硝酸盐，并在肥料流失到河流和地下水中，导致河流、湖泊和沿海水域富营养化方面发挥关键作用。同样的两种工艺也被用于废水处理厂，作为常规脱氮的第一步（Box.2）。
Box.2 污水处理中微生物脱氮
1.5 一氧化氮还原为一氧化二氮或二氮气体
一氧化氮是一种信号分子也是一种毒素，是反硝化、硝化和厌氧氨氧化过程的中间产物。此外，进行产氧反硝化的细菌将两个一氧化氮分子歧化为一个二氮气体分子和一个氧分子。因此，可以在广泛的环境中发现能够还原一氧化氮的微生物，包括废水处理厂、农业土壤和海洋沉淀物。微生物还原一氧化氮（图1）是一氧化二氮的主要来源，一种强大的温室气体（比二氧化碳强310倍）和主要的臭氧消耗剂。产生一氧化氮还原酶（NOR）的一氧化二氮用于一氧化氮的解毒或呼吸，属于从黄素蛋白到血红素铜氧化酶的一组酶。NOR型酶是真菌线粒体中的NADHdependent细胞色素P450NOR，如镰刀菌oxysporum，以及最近在大肠杆菌中发现的杂交簇蛋白HCP。血红素铜氧化酶家族含有末端氧化酶、细胞色素c依赖的cNOR、醌依赖的qNOR和含铜的CuANOR，它们都在一氧化氮的呼吸中起作用。一氧化二氮是反硝化的中间产物，也不存在于反硝化细菌和假单胞菌中。在一些微生物中，一氧化二氮也可能是反硝化的最终产物，例如绿脓杆菌。氨氧化细菌可以在硝化-反硝化过程中产生一氧化二氮，在硝化-反硝化过程中，NOR用于还原亚硝酸盐还原形成的一氧化氮。在氨氧化细菌和能够进行氨处理的细菌的培养物中，也可以通过细胞外介导羟胺和一氧化氮的非生物反应形成一氧化二氮。此外，氨氧化细菌可以通过一氧化氮的非催化还原产生一氧化二氮，而一氧化氮是在羟胺氧化过程中产生的。与氨氧化细菌类似，甲烷营养细菌通过羟胺氧化（见上文）和亚硝酸盐还原形成的一氧化氮的非催化还原产生一氧化二氮。相比之下，氨氧化古生菌中一氧化二氮的产生可能只与中间产物一氧化氮和羟胺的非生物反应有关。氮基肥料的使用大大增加了一氧化二氮的排放量。由于氮转化微生物的协同作用，3-5%的农用氮转化为氧化亚氮。氮基肥料越来越多地被用于种植用于生物燃料生产的作物（化石燃料的潜在替代品）。这是一个进退两难的问题——用于生产生物燃料的肥料越多，一氧化二氮的排放量就越大。因此，用于生物燃料生产的肥料抵消了通过减少化石燃料的使用而实现的温室气体排放的减少。
1.6 一氧化二氮还原为氮气
微生物一氧化二氮还原为氮气是这一强大温室气体的汇。唯一催化这一反应的已知酶是一氧化二氮还原酶（NOS）。不同的细菌，包括蛋白质细菌、拟杆菌和氯杆菌门的成员，以及古细菌都利用NOS。有趣的是，编码NOS变体的生物体通常没有其他氮氧化物还原酶。一些真核生物也能减少一氧化二氮，但它们的酶机制尚不清楚。长期以来，人们认为NOS比其他氮氧化物还原酶对氧、pH和硫化物更敏感。基于这种明显的敏感性，氧化亚氮的环境排放完全归因于抑制生物体内的NOS，这些生物体将硝酸盐一路还原为氮，即所谓的完全反硝化菌。此外，所谓不完全反硝化菌的相互作用，例如亚硝酸盐还原为氧化亚氮或氧化亚氮还原为二氮气体，它们的生态位分化可能导致许多环境中氧化亚氮的生产和消费之间的不平衡，例如土壤和海洋环境。
转化氮的微生物有着惊人的多样性，每一种微生物都有不同的生理需求以获得最佳生长。由于自然界的生长条件是高度可变的，很少是最优的，因此单个微生物的氮素转化必然是低效的。然而，环境中的氮转化是由比单一微生物更有效地循环氮的微生物群落进行的。因此，很少有可供生物利用的氮逸出到大气中，少量的二硝基气体损失通过固氮平衡（Box1）。这种明显的氮稳态不仅是全球生物圈的特征，而且也是许多生态系统的特征，如森林土壤和海洋环流。在这些生态系统中，有效循环氮所需的微生物群落即使在物种组成因环境扰动而改变时，仍保持氮转化反应。氮转化反应是由在自然和人工生态系统中形成复杂网络的微生物连接起来的（图3）。
海洋环流是世界上最大的生态系统，由于广泛的氮循环，几乎达到氮平衡（图3a）。在这里，主要的氮转化过程是蓝藻的氮同化，如海洋前氯球菌，浮游动物的氨化和异养细菌（Box1；图3a）。微生物固氮作用，如毛癣菌属和是一个相当小的氮转化过程。然而，由于固氮发生的区域非常广阔，它是向海洋提供新的生物可利用氮的主要来源。与海洋环流相反，最小含氧量区水域覆盖的开阔海域不到1%，但可能占海洋氮损失的30-50%（Box1）。在这里，厌氧微生物，如“Scalindua假丝酵母”与好氧微生物共存。开放海洋氧气最小区的微生物氮转化网络是复杂的，所有已知的氮转化过程都是同时发生的（图3b）。
脱氮污水处理厂与缺氧区水体相似，具有氮转化不平衡的特点。这些人造系统的设计目的是将氨转化为二氮气体，二氮气体会流失到大气中（Box2）。
农田是最大的人工生态系统之一，其微生物氮素转化网络受到人为输入氮素的强烈影响。与固氮微生物共生的豆科植物种植大大增加了对环境的氮输入。固氮微生物，如慢生根瘤菌，通常生活在特殊的根瘤中，为豆科植物提供铵（图3c）。泄漏到周围土壤中的铵会促进其他微生物的氮转化，如好氧氨氧化。在稻田中，工业肥料的使用导致了强烈的硝化作用，增加了氮素损失。最近的研究表明，这些系统具有高度复杂的氮转化网络，其中包括亚硝酸盐还原（Ca.Methylomirabilis spp.）和硝酸盐还原（Ca.Methanoperedens spp.）（图3d）。
图3 不同生态系统中潜在的氮转化微生物网络
结论
识别形成氮转化网络的因素需要对相关微生物的生理学有更深入的了解，并对其生态学和进化有更深入的了解。所有微生物中只有一小部分被培养，而未培养的大多数可能含有未发现的代谢途径（Box.3）。经过艰苦的生物化学、生理学和基因组学鉴定，相关结论已经改变了我们对关键氮循环过程的看法。好氧亚硝酸盐氧化菌和厌氧氨氧化菌具有前所未有的代谢多样性，这使得它们仅仅被归类为好氧亚硝酸盐氧化菌或厌氧氨氧化菌是不够的。在环境中，许多好氧亚硝酸盐氧化剂可以作为氢氧化剂、氨氧化剂或硝酸盐还原剂生长。厌氧氨氧化细菌也可以使用短链脂肪酸、甲胺和铁（ii）作为电子受体，它们可以使用硝酸盐、Mn（iv）和Fe（iii）作为电子受体。毫无疑问，按照经典的六种氮循环过程来对生物体进行分类将变得越来越困难。
Box3.未发现的生化反应
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