科研 | Nature子刊：宏基因组关联分析揭示使用抗生素后肠道环境恢复的关键微生物因素
编译：Mushroom，编辑：小菌菌、江舜尧。
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抗生素治疗会导致肠道微生物群落多样性持续降低，这会影响微生物群落的功能，抗菌素的耐药性，甚至可能影响宿主健康。然而，有关促进肠道菌群恢复的物种和代谢功能的理解仍是不足的。
本研究收集4组人群的粪便数据，从中确定与抗生素治疗后的肠道生态恢复呈强相关的21种细菌（RAB）。功能和生长速率分析表明，特定的碳水化合物降解和能源生产途径的富集可以促进肠道菌群的恢复。从MEDUSA数据库中对782个微生物数据进行关联规则挖掘，并借此重建肠道微生物食物网，将许多具有利用宿主和饮食来源能源能力并支持其它肠道物种再繁殖的细菌确定为与肠道恢复相关的关键物种。小鼠模型实验总结了与肠道恢复相关的细菌（拟杆菌和青春双歧杆菌）在协同作用下促进恢复的能力，即在早期微生物丰度提高两个数量级，微生物多样性增长更快。鉴定与促进肠道恢复和代谢功能有关的肠道微生物，为日后对使用抗生素生物提供保护的益生菌配方的研究提供了参考。
论文ID
原名：Metagenome-wide association analysis identifies microbial determinants of post-antibiotic ecological recovery in the gut
译名：全宏基因组关联分析揭示使用抗生素后肠道生态环境恢复的关键微生物因素
期刊：Nature Ecology & Evolution
IF：12.541
发表时间：2020.7
通讯作者：Niranjan Nagarajan
作者单位：新加坡基因组研究所，新加坡国立大学永禄林医学院
实验设计
收集来自4个国家（新加坡（SA），加拿大（CA），英国和瑞典（SW，EN））的4组人群的纵向肠道微生物数据（表1，共117个使用不同类型抗生素的不同年龄阶段的个体），进行分类和功能分析并根据抗生素使用后微生物多样性是否可以恢复到使用前的水平将每组人群分为恢复组和未恢复组，而后进行关联分析。此外，对常规健康小鼠（C57BL/6J、肠道发育正常、粘蛋白生成正常）连续给予抗生素5天，间隔1天后随机分为4组进行灌胃:一级RAB拟杆菌（Bt）；三级RAB青春双歧杆菌（Ba）；拟杆菌和青春双歧杆菌（Bt + Ba）的组合；磷酸盐缓冲盐（PBS）。在22天中，每3天收集粪便样本并使用鸟枪宏基因组测序及qPCR分析小鼠肠道微生物组（图4）。由此揭示与肠道菌群恢复相关的微生物标记以及复杂的生态过程。
结果
使用抗生素后，大多数个体的肠道微生物多样性呈正u型分布（在抗生素治疗期间显著下降），然而在使用抗生素治疗停止后的三个月有所不同：恢复组的微生物多样性接近使用抗生素之前的水平，而未恢复组的微生物多样性仍然很低（图1a）。与未恢复组相比，恢复组暂停使用抗生素后的微生物群落与健康对照组的总体微生物群落更为相似（图1b,1c）。补充图1b表明在队列间和不同的多样性指标中结果一致。此外，恢复组与未恢复组间的微生物多样性在使用抗生素之前无显著差异（P > 0.05）。
共有21种微生物在至少2组数据中被鉴定为与微生物组恢复显著相关（RAB；表2），10种微生物在3组数据中被鉴定，1种微生物在4组数据中均表现为与肠道微生物恢复显著相关（拟杆菌；图1d）。组间的差异可能反映了饮食、环境和抗生素使用的差异，而属水平的一致（拟杆菌属；图1d，表2）可能反映了生物种的功能冗余。恢复组和未恢复组的RABs分布表明，肠道微生物的数量可能影响其恢复。此外，多个RABs的联合作用可能是肠道微生物能否成功恢复的关键因素。
不同阶段RABs的丰度模式显示部分微生物在抗生素处理前的富集量高出2-4倍，而其它微生物则在较晚的时间点富集，这表明它们可能在肠道恢复中起次要或协同作用（补充图2），RABs的组合效应可能在肠道恢复过程中发挥作用。有趣的是，恢复组和未恢复组肠道菌群的RABs多样性虽然发生变化但始终存在，这表明它们没有特定的抑制作用。对样本的计算机分析模型表明，使用抗生素前的微生物分类丰度可以在一定程度上预测抗生素后的恢复状态（准确率：70.4%）。
图1 肠道微生物的恢复情况和主要相关类群。a，抗生素使用人群（CA，SG）中观察到的两种不同微生物多样性恢复曲线的密度图。b主成分分析图显示恢复组和未恢复组在使用抗生素后肠道菌群分布与健康对照组肠道菌群分布的关系（CA；恢复组n = 8，未恢复组n = 7，对照组n = 18）。c，箱线图显示与健康对照组相比，恢复组和未恢复组在使用抗生素后肠道微生物群的Bray Curtis距离分布（中位数；CA；恢复组n = 8，未恢复组n = 7）。* * * P < 0.001（单次Wilcoxon检验）。基于所有时间段，在至少3组中确定的6个RABs的相对丰度箱线图（表2）。* P < 0.05,** P < 0.01和***P < 0.001（单次Wilcoxon检验；恢复组样本数分别为24（CA），32（SW），16（EN）和41（SG），未恢复组样本数分别为21（CA），24（SW），24（EN）和22（SG）。箱线图以中心线表示中位数，盒的上限和下限分别表示上、下四分位，上下须表示1.5×的四分位差；图中未显示离群点。
第5组（在新加坡国立大学医院中服用抗生素的健康年轻人，表1）的宏基因组数据被单独分析。其中12种被认为与肠道恢复显著相关的物种与之前被鉴定出的21种RABs重叠，10-17个物种与4组原始数据中RAB物种相似（表2），这表明这些RABs与肠道恢复之间的关联性不受人群年龄、所处位置和使用抗生素类型的影响。将数据纳入关联分析后仅新增2个RABs，突出了本研究的一致性和重复性。
2. 碳水化合物降解和能量代谢途径的富集作为RABs促进微生物群落恢复的枢纽
恢复组和未恢复组的宏基因组数据中所有差异丰富的基因和通路（CA和SG组，补充数据3）显示有一组与氨基酸、核苷酸、辅助因子和细胞壁成分生物合成相关的生长途径（补充图3）。此外，参与碳水化合物降解和能量生产的途径在肠道微生物中显著过剩。SW和EN组在治疗前和治疗期间的16S RNA谱推测的通路丰度分析进一步证实了这些关联（补充图4和补充数据3）。相比之下，恢复组和未恢复组的耐药分析显示在抗生素使用前和使用期间，RABs没有显著富集，这表明抗生素耐药功能一般不能解释观察到的分类学差异（补充图5）。
表2 RAB类群列表
对恢复组和未恢复组的肠道宏基因组和RABs注释碳水化合物活性酶（CAZyme）。结果显示，与未恢复组相比，恢复组RABs的CAZyme和宏基因组均显著富集（图2a，图2b，补充数据4），这与补充图3中的富集途径一致。
本研究认为，RABs较高的碳水化合物代谢能力可以获得更好的营养，从而促进生物合成和微生物生长（补充图3）以及随后的肠道微生物的恢复（图2）。补充数据5显示恢复组的微生物群落总体增长率在抗生素使用阶段均高于非恢复组（图2c）。在抗生素使用前和使用期间，RABs的丰度与个体使用抗生素后的群落增长率显著相关（图2d）。最后，在CA组和SG组中，各时间点的群落增长率均与CAZyme数量呈正相关（图2e）。综上所述，RABs富集、碳水化合物降解潜力、微生物群落生长速率和微生物群落恢复作为RABs促进恢复的可能机制的连续步骤。
3. 特定的碳水化合物降解功能决定了RABs在肠道微生物食物网中的作用。
基于细菌全基因组的底物特异性酶拷贝数，对一组137个细菌基因组进行聚类，得到5个不同的集群（补充图6）。结果显示RABs聚集在其中2个集群且在以包含宿主来源（粘蛋白）和食物来源（植物和动物）的碳水化合物降解酶丰富为特征的集群1中显著富集。少数RABs属于以食物来源（植物和动物）的碳水化合物降解酶为特征的集群2，而在集群3、集群4和集群5中（分别是以淀粉、真菌碳水化合物和肽聚糖降解为特征）较少，这突出了特定的碳水化合物降解过程在微生物群落恢复中的重要性。
基于关联规则挖掘的数据驱动方法（来自MEDUSA数据库的782个微生物组）显示肠道微生物之间的关系产生的网络图包含1166条有向边连接266种直接从肠道微生物数据（补充数据6）中识别出来的细菌，并概括了几种已知的交互共生的相互作用（拟杆菌属和梭状芽孢杆菌属）。
图2 微生物功能与恢复的机制模型。微生物群落恢复模型的证据是增加RABs的碳水化合物（CAZyme）降解能力促进了群落的增长速度，并最终促进微生物群落的恢复（关联用蓝色突出显示）。CGR，群落增长率。a，恢复组和未恢复组中RABs的CAZyme数量经验分布表明，RABs的CAZymes是强富集的（双侧Wilcoxon检验）。b，CA和SG组中恢复组和未恢复组肠道菌群中CAZyme数量变化（所有时间点；恢复组n = 24（CA）, n = 41（SG），未恢复组n = 21（CA）, n = 22（SG））。在两个组群中，恢复组的宏基因组中有更多的CAZyme（单侧Wilcoxon检验）。c，CA和SG组（所有时间点；恢复组n = 24（CA）, n = 41（SG）；未恢复组n = 21（CA），n = 22（SG））。d，与抗生素使用前和使用期间的未恢复组的RABs相比，恢复组的RABs丰富度与CA组中个体治疗后群落增长率的相关性更高（经验分布；单侧Wilcoxon检验；恢复组RANBs的n = 21；非恢复组RABs的n = 89；SG组P > 0.1）。e，检测到的CAZyme酶的数量与构成CA和SG组（所有时间点）的肠道微生物群落总体生长速率之间的相关性。灰色阴影区域为95%置信区间。在两组中，群落增长率与CAZyme多样性一致相关。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。散点图的线代表中值。
图3 RABs通过微生物食物网在生态恢复中的作用。a，使用关联规则挖掘方法推断出的微生物依赖关系的网络结构，其中从物种A到物种B的边缘表明A的存在需要B的存在。节点从底部到顶部排列，这样底部物种的向内比向外多（一级物种），而顶部物种向外比向内多（三级物种）。在图表的底部或顶部可以观察到RABs（不同属用不同的颜色突出显示）。图表底部的许多RABs来自集群1（补充图6），被定义为粘蛋白降解CAZymes。基于时间的丰度配置的集群（补充图2）使用数字表示，在图的不同区域似乎没有偏倚。b，肠道示意图显示基于这些观察结果的微生物恢复模型。集群1的RABs有粘蛋白降解功能（步骤1，补充图6），因此对上皮粘膜有较好的定植作用。由于它们可以分解饮食中植物和动物来源的碳水化合物（步骤2），所以作为促进生长的主要物种（步骤3）。一些三级RABs和其它物种可以产生短链脂肪酸（SCFAs），这些短链脂肪酸用于生长，导致粘蛋白产量增加（步骤4）。这种正反馈循环可能加快生物多样性和生物数量方面的生态恢复。
食物网显示仅有少数物种是其它物种生存的必要条件（有许多向外的边缘），而绝大多数物种的存在依赖于其它物种（有许多向内的边缘）。一个基于物种向外到向内边缘（从下到上）的差异可视化的金字塔网状结构（RAB节点突出显示，图3a）显示许多属于聚类1的RABs也相应地富集了粘蛋白酶，聚集在这个网络的底部三分之一（一级物种）。网络中间三分之一（二级物种）没有发现RABs，而网络顶部三分之一的RABs属于一个多样化的CAZyme簇（三级物种）。这意味着一些RABs应该是触发种群恢复的关键物种（一级物种），而另一些则在后期发挥协同作用或作为生态恢复的指示物种（三级物种）。
总而言之，RABs的碳水化合物降解情况及其在食物网中的作用与模型一致（图3b），其中:
（1）主要RABs利用其粘蛋白降解能力成功地在肠道上皮细胞上定植/重新定植；一些主要RABs负责分解复杂饮食来源碳水化合物；
（2）这有助于启动一个互利共生的相互作用链，支持不能降解粘蛋白和/或依赖于复杂碳水化合物分解为单糖的其它细菌（二级或三级）的再繁殖；
（3）随着微生物群落的再生，一些RABs有助于产生短链脂肪酸，而这些脂肪酸反过来为结肠系膜细胞提供能量；
（4）粘蛋白产量的增加创造了一个积极的反馈循环，推动微生物的快速恢复。其总体效果是在肠道微生物生态系统中重建一个新的可以体现微生物多样性的互作网络。
4. 小鼠模型概述了一级和三级RABs在体内的协同作用
结果显示恢复组的RABs之间代谢互利比未恢复组多，特别是三级RABs的代谢受益于其它物种,包括主要RAB-拟杆菌（补充图7和补充数据7）。
图4b显示使用抗生素后小鼠肠道微生物量减少了3-log。从小鼠被灌胃后第1天开始，Bt和Bt + Ba组的微生物恢复量显著提高，第4天明显提高（> 100倍；图4b，补充图8a）并逐渐恢复到使用抗生素前的水平，而PBS和Ba组在第22天微生物量仍然低于抗生素前水平。补充图9显示微生物的成功定植可能也会促进肠道生态恢复（芽孢杆菌）。在第19天和第22天，Bt + Ba组的微生物群落多样性最高（图4c）。在第22天，Bt + Ba组重建了一个比Bt组更接近使用抗生素前的肠道群落（补充图8b）。这些结果表明，单独使用Bt足以恢复生物量，但单独使用Ba则不能。Bt和Ba的结合可以协同促进生物量和多样性的恢复。粘蛋白的富集以及膳食碳水化合物降解途径（不包括肽聚糖降解）与Bt和Bt + Ba组的促肠道恢复过程相关（图4d-4f）。
图4 使用RABs促进小鼠模型微生物组的恢复。a，示意图描述了研究RABs促进小鼠模型微生物恢复的实验设计。连续给予小鼠抗生素5天，间隔1天后灌胃不同的RABs（对照组:n = 5、Ba: n = 6、Bt: n = 2、Bt + Ba: n = 2，其中n代表笼单位）。然后每三天使用鸟枪宏基因组学监测微生物组变化。b，不同组小鼠随时间变化的微生物量（不包括灌胃物种，中位数±1MAD）。c，不同组小鼠随时间变化微生物的多样性。Bt + Ba组与其它组差异显著的时间点*P < 0.1（单侧Wilcoxon检验）。d-f，在不同的实验组和时间点与植物细胞壁/动物碳水化合物（d）、粘蛋白（e）和肽聚糖（f）降解相关的CAZymes（中位数±1MAD）。* * P <0.01，Bt和Bt + Ba组与其它组差异显著的时间点（单侧Wilcoxon检验）。
结论
评论
尽管越来越多的证据表明肠道菌群功能的重要性以及抗生素对肠道菌群功能的影响，但我们对使用抗生素后肠道恢复过程的理解是有限的。因此，本研究通过对人群肠道微生物的全宏基因组分析以揭示与肠道生态恢复相关的微生物标记及复杂的生态过程。在这项研究中，由数据挖掘技术确定的微生物食物网可以帮助人们理解微生物在人类肠道中相互作用和聚集的方式。对微生物食物网更广泛的理解可以为合理设计益生菌制剂奠定基础，从而促进肠道微生物群的功能和生态恢复。
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